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浙江中医杂志2019年3月第54卷第3期
**基金项目：金华市社会发展类重点项目毛花称猴桃根抗肿 瘤有效活性成分提取及其抑瘤作用研究，编号：2016-3-003# 通讯作者：朱婉萍,E-mail : zhwanp@163. com
张家敏’张骋？王鹏'王建英：王楠楠朱婉萍
1浙江省金华市人民医院 浙江金华3210002浙江大学医学院附属第一医院 浙江 杭州310003
3浙江省中医药研究院 浙江 杭州310007
摘要 目的：研究白藤梨根提取物体内外抗肿瘤的活性和作用机制 方法：体外人肺癌A549细胞培养考察 白藤梨根对肺癌细胞的抑制作用；体内采用S180实体瘤裸鼠实验考察白藤梨根对S180肉瘤、体重、胸腺指
数、脾脏指数以及Bcl-2/Bax 表达的影响：结果：白藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞增殖有较为明 显的抑制作用，其IC50值为0. 39mg/ml ；体内可显著抑制S180肉瘤的生长（P<0. 01），其平均抑制率为
30. 8%，显著降低脾脏指数，但对胸腺无明显抑制作用；白藤梨根乙酸乙酯提取物能显著降低Bcl-2蛋白（P <0. 05），升高Bax 蛋白（P<0. 01），使Bax/Bcl-2的比值升高：结论：白藤梨根乙酸乙酯提取物能抑制肺癌
A549细胞的增殖；体内能抑制荷瘤裸鼠S180肉瘤的生长，并通过调节Bax/Bcl-2的比值来诱导细胞凋亡， 进而发挥抑瘤作用
关键词白藤梨根肺癌A549 S180肉瘤裸鼠
白藤梨根来源于獗猴桃科獗猴桃属植物毛花獗猴 桃（Actinidia er i a nt h a Ben th ）的干燥根具有清 热、利湿、活血、消肿、解毒等功效，为浙江民间习用药
材。白藤梨根是畲族民间常用的药材，被广泛用于抗肿 瘤的。现代临床疗效及基础研究结果表明白藤梨根 具有显著的抗肿瘤、免疫调节等作用 W 本次以白藤梨 根为研究对象，初步探讨白藤梨根提取物体内外抗肿瘤 作用，为临床应用和新药开发提供实验依据。
1材料
1. 1动物：SPF 级BALB/c-nu 裸鼠40只，雄性，体重
20±2g，购于浙江省实验动物中心，许可证号:SCXK （浙） 2014-0001，由浙江省中医药研究院实验动物中心饲养。
1.2细胞株：人肺癌A549细胞株均购于中科院细胞 库.由浙江省中医药研究院实验室液氮保存。
1.3药物：白藤梨根采自浙江省武义县，经金华职业
技术学院中药学专业吴远文副教授鉴定为徹猴桃科 獗猴桃属毛花》弥猴桃（Actinidia er i ant h a Benth ）的 干燥根:RPMI-1640培养液（批号:16011505）、0. 25%胰 蛋白酶（含 0. 02%EDTA .批号：2016062902）、PBS （批号：
2016061304）均购于吉诺生物医药技术有限公司；胎牛 血清（批号= 20160323）购于浙江天杭生物科技股份有限 公司；注射用环磷酰胺（Baxter，批号:6F124A ）,Bcl-2
抗肿瘤
抗体（三鹰，批号：60178-l-Ig ）,Bax 抗体（三鹰，批号：
50599-2-Ig ） , HRP 标记山羊抗兔二抗（Servicebio，批 号:G23303），组化试剂盒DAB 显剂（Servicebio，批
号:G1211）。
1.4 仪器:Buchi R-210型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI 实 验室仪器公司）;Centrifuge 5810R 低温离心机（Ep- pendorf 公司）；3111 型 CO ：培养箱（Thermo 公司）；
CK40-F200型倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司）；xCELLi-
gence RTCA DP 多功能实时无标记细胞分析仪［艾森生 物（杭州）有限公司］;TC-20细胞计数仪（Bio-Rad 公
司）。2方法
2. 1样品的制备：取白藤梨根经烘箱65°C 烘干，高速
粉碎机粉碎过筛.得到白藤梨根粉末。称取1000g 白藤 梨根粉末，用5倍量的石油醯浸泡30min，超声提取3
次，每次30min，收集提取液，过滤，合并滤液，减压浓 缩，得到石油脱浸膏；将药渣挥干溶剂.加5倍量乙酸乙 酯浸泡过夜，倒入渗漉装置中，用10倍乙酸乙酯渗漉提
取，渗漉速度为2ml/min，收集渗漉液，过滤，合并滤液， 减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏；将药渣挥干溶剂.用5倍
量的95%乙醇浸泡过夜，10倍量的95%乙醇渗漉提取， 渗漉速度为2ml/min，收集渗漉液.过滤.合并滤液.减
压浓缩得到乙醇浸膏。将药渣挥干溶剂，按料液比1:30
的水回流提取，提取2次，每次2h .收集提取液，过滤.水 浴蒸干，得到水提物。
2. 2 白藤梨根体外抗A549细胞增殖的影响：分述如
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下
2.2.1样品的配制：精密称取“2.1”提取得到片藤梨根石油醸、乙酸乙酯和乙醇提取物浸膏.用培养基配制成50mg/ml和100m g/ml溶液(含0.2%DMS0)，水提物用PBS 缓冲液配制成50mg/ml和1OOmg/m1溶液.4°C冰箱中保存备用。
2.2.2RTCA DP实时细胞分析系统检测提取物对A549细胞活性的影响：取对数生长期的A549细胞(5X10')，用胰酶消化后接种于E-Plate板上，置37°C.5%CO?培养箱中培养24h，记录细胞指数(CI)°24h后加药，设正常对照组、0.2%DMS0对照组、石油瞇、乙酸乙酯、乙醇和水提物分别为(100、50u g/ml)，每组设3复孔，继续培养72h，记录CI值。
2.3白藤梨根对裸鼠移植瘤S180肉瘤的抑制作用：分述如下。
2.3.1S180荷瘤裸鼠动物模型的建立⑷：传代培养S180肉瘤细胞.收集生长期细胞，以无菌生理盐水调整细胞浓度至lXKT/ml，取40只裸鼠，每只裸鼠右腋下接种0.2ml。
2.3.2动物分组与给药：于接种后第2天称取裸鼠体重，随机分为5组.每组8只，分别为模型(A)组、环磷酰胺(B)组(50mg/kg)、乙酸乙酯提取物(C)组(0.5g/kg)，乙醇提取物(D)组(2.5g/kg)和水提物(E)组(3.Og/kg)，每组8只。各组裸鼠于分组后开始按0.02ml/g灌胃给药，环磷酰胺组按腹腔注射50mg/kg隔日给药
2.3.3检测指标：每日称重并观察裸鼠肿瘤生长情况，末次给药24h后，用游标卡尺测量肿瘤的最大径及最小径，计算肿瘤体积颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，取出肿瘤组织、胸腺及脾脏，称瘤重及脏器重量，并计算抑瘤率及脏器指数。肿瘤体积=l/2XaXb2(a：肿瘤最大径，b：最小径)。抑瘤率=(1-T/C)X1OO%(T：给药组平均瘤重,C：模型组的平均瘤重)
2.3.4免疫组化染：取瘤体称重后,4%甲醛固定，常规石蜡包埋切片.脱蜡，光镜观察和水化，加入3%HO处理10min以灭活内源性酶，PBS洗涤3次，每次5min，每张切片分别滴加Bcl-2.Bax抗体，于4°C孵育，按试剂盒操作.DAB显，封片.光镜观察:、结果判定：以胞浆中岀现棕黄颗粒为阳性应用图像分析系统记录平均光密度值(A0)，作为蛋白表达的量化指标。
2.4统计学方法：各组数据用匚±$表示，多组间均数比较采用方差分析，所有数据均由SPSS19.0统计软件进行处理,P<0.05为统计学上差异有显著性。
3结果
3.1白藤梨根提取物对A549细胞活性的影响：由表1可见，与正常对照组和0.2%DMS0对照组相比，石油瞇、乙酸乙酯、乙醇提取物给药浓度为100u g/ml时对A549细胞均有较好的抑制作用(P<0.05,P<0.01)，其中乙酸乙酯提取物的抑制作用最为明显。因此选择乙酸乙酯提取物进行CI值检测，结果见表2，乙酸乙酯提取物对A549细胞有较好的抑制作用，经计算乙酸乙酯提取物对A549细胞48h的IC50为0.39mg/ml。
表1RTCA DP实时细胞分析系统检测4种提取物对A549
细胞活性的影响(X±5)
组别n24hCI48hCI 正常对照组3 4.478±0.065 6.351±0.301
0.2%DMS0对照组3 4.275±0.174 6.096±0.177 100u g/ml石油醯组3 1.847±0.053" 2.362±0.065
*5
50u g/ml石油瞇组3 3.748±0.122
* 5.933±0.064 100u g/m1乙酸乙酯组30.188±0.064
**sa0.115±0.033
*5
50u g/ml乙酸乙酯组3 3.906±0.034
** 5.401±0.049 100u g/ml乙醇组3 2.264±0.093
**sa 3.075±0.042
*°°50u g/ml乙醇组3 4.135±0.066
* 5.545±0.078 10011g/ml水提取组3 4.333±0.105 5.951±0.067 50u g/ml水提物组3 5.3U±0.094
**c 6.994±0.127s 注：与正常对照组比较，*P<0.05,**
P<0.01；与0.2%DMS0对照组比较.#P<0.05,##P<0.01。
表2乙酸乙酯提取物对A549细胞活性的影响(%±5)组别n24hCI48hCI 正常对照组3 2.154±0.079 3.544±0.118 0.2%DMS0对照组3 2.092±0.069 3.674±0.035
200u g/ml组30.245±0.OIL0.194±0.OU
**88 100M g/ml组30.116±0.010
**320.084±0.028
**sa 50u g/ml组3 1.290±0.02严 2.056±0.070
**BO 25u g/ml组3 1.702±0.035
**ss 2.725±0.096
*®
12.5u g/ml组3 1.626±0.059
**" 2.762±0.098
**08
6.25u g/ml组3 1.458±0.073ws 2.322±0.104
**sn 注：与正常对照组比较.**
P<0.01；与0.2%DMS0对照组比较.##P<0.01。
3.2白藤梨根提取物对S180荷瘤裸鼠的影响：分述如下。
3.2.1白藤梨根对S180荷瘤裸鼠瘤体积、重量及对S180荷瘤小鼠脏器指数的影响：表3结果表明，与模型对照组相比较，环磷酰胺组和乙酸乙酯提取物组均能显著抑制S180肉瘤体积的增长(P<0.01)，环磷酰胺组、乙酸乙酯组和乙醇组能显著降低S180肉瘤的重量(P< 0.01,P<0.05)，白藤梨根不同提取物对胸腺指数与模
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型组相比无显著性差异，但是水提物组有明显的升高趋
势；白藤梨根乙酸乙酯组和乙醇组与模型组相比，脾脏 指数有明显的抑制作用(P<0. 01)，而水提物组对脾脏buchi
指数并没有显著性差异。
3. 2. 2白藤梨根对Bcl-2和Bax 蛋白表达的影响：结果 如表4所示，与模型对照组比较，环磷酰胺给药组能明
显降低肿瘤中Bcl-2蛋白的表达(P<0. 05)，且能明显 增强Bax 蛋白的表达(P<0.01)；白藤梨根不同提取物 对Bcl-2蛋片的表达均有一定程度降低，其中乙酸乙酯
给药组和水提物组对Bcl-2蛋白的表达有明显的抑制 作用(P<0. 05)；白藤梨根不同提取物对Bax 蛋片的表
达均有一定程度升高，其中乙酸乙酯提取物能明显促
进Bax 蛋白的的表达(PV0.01)；与模型对照组相比 较，白藤梨根不同提取物对Bax/Bcl-2的比率均有一
定程度的升高，其中乙酸乙酯提取物组对Bax/Bcl-2
有明显的升高作用(P<0. 05)o
表3白藤梨根不同提取物对S180实体瘤的抑制作用及对脏器指数的影响G±s)
组别 剂量 给药前体重(g)给药后体重(g)肿瘤体积(mnr ‘)肿瘤重量(g)抑瘤率(％)胸腺指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)A 组
—
17.2±1. 116.7±1.51714±448 1.99±0. 49—0. 78 ±0. 20s8 5. 23 土 1. 79BS B 组50mg/kg 17. 1 ±1.014. 8±0. 8**576 ±330**
0. 49 ±0. 24**75. 590. 25±0. 11**
2. 58±0. 35**
C 组0. 5g/kg 17.0±1.2
15. 3±1.5*
1110±309** 1.38±0. 29**30. 800. 74±0. 3688 2. 98±1. 13**D 组 2.5g/kg
17. 1±1. 315.6±1.51414±288 1.57±0. 24*
20. 930. 64±0. 33= 2. 77±1. 12**E 组
3. Og/kg 17. 1±1. 7
16. 4±2. 3
1544±553
1.75+0.31
12. 18
0. 95 ± 0. 3980
4. 02 ±2. 15
注：与 A 组比较,*P<0. 05,**P<0.01；与B 组比较,#P<0. 05,#ttP<0.01…
表4白藤梨根不同提取物对Bcl-2及Bax 蛋白表达情况 的影响(%±s)
分组
Bcl-2
Bax Bax/Bcl-2
A 组0. 016±0. 0140. 0090 ±0. 0095 1. 12±1. 71
B 组0. 0066 ±0. 0053*0. 041±0. 024**
5. 94±4.61*C 组
0. 00658 ±0. 0033*
0. 022±0. 011** 3. 72 土 2. 94*D 组0. 0078 ±0. 00660. 019±0. 014
2. 53±2. 97
E 组
0. 0062 ±0. 0025*
0. 0080 ±0. 0033
1. 41±0. 46
注：与 A 组比较,*P <0. 05,**
P<0.01o
4讨论
白藤梨根性寒、味苦涩，《中药大辞典》中记载具有
“清热、利湿、活血、消肿、解毒”等功效。在《全国中草药 汇编》中记载白藤梨根能胃癌、乳腺癌、食管癌等疾
病。白藤梨根是畲族民间习用药材，也是浙中西部地区
的常用药材，其抗消化道肿瘤方面已有不少报道间。中 药中的化学成分复杂，其有效作用成分并不明确，因此
去粗存精.去除中药中多余杂质，阐明中药的药效物质 基础是中药现代化的研究方向之一。
研究发现肿瘤的发生与细胞凋亡异常密切相关，因 此诱导细胞凋亡成为评估抗肿瘤药物疗效的一项新指
标o Bcl-2和Bax 是近年来研究发现与肿瘤细胞凋亡明 确相关的基因w o Bcl-2基因能使细胞长期存活，抑制细 胞凋亡，而Bax 基因功能则刚好相反，主要促进细胞凋
亡。研究表明，Bax 和Bcl-2调节细胞凋亡不仅取决于自
身表达的高低，还与Bax/Bcl-2的比率有关，当比率大
时，细胞趋于凋亡"叫本次实验研究发现，白藤梨根乙
酸乙酯提取物中促凋亡基因Bax 蛋白表达量升高(P< 0.01)，抑凋亡基因Bcl-2蛋白表达量降低(P<0. 05),
且Bax/Bcl-2比值升高(P<0. 05)。研究结果证实，白藤 梨根乙酸乙酯提取物具有较好的体内外抗肿瘤活性，其 抗肿瘤作用主要通过降低Bcl-2蛋片的表达，升高Bax 蛋白的表达，使Bax/Bcl-2比率升高，促进肿瘤细胞
凋亡。
5参考文献
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收稿日期 2018-11-20
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