食品中10种素的高效液相谱同时检测方法
李小云;赵喜玲;李琪;宋丹萍;曾慧;张宏
【摘 要】To establish a method for simultaneous determination 10 kinds of yellow pigments in food with high performance liquid chromatography (HPLC).The pigments were extracted with methanol from drinks,candy and cake samples.The HPLC detection conditons were methanol (A),0.02 mol/L ammonium acetate solution (B),acetonitrile (C) as the mobile phase gradient,Macherey-Nagel C18 column (4.6 mm×250 mm,5 μm) as the stationary phase,column temperature 25 ℃,the flow rate 1.0 mL/min,detection wavelength 435 nm,injection volume 20 μL.The linear range of 10 kinds of pigment were 0.25~160.0 μg/mL,and the recoveries in drinks,candy,cakes samples were 88.0%~103.6%,88.0%~98.3%,81.4%~106.7%.This method showed good reproducibility,sensitivity and accuracy and it could be applied for determination of 10 kinds of yellow pigments in food.%采用高效液相谱法建立食品中10种黄素的检测方法.甲醇作为溶剂对饮料、糖果、糕点3类样品进行提取,甲醇(A)-0.02 mol/L乙酸铵溶液(B)-乙腈(C)为流动相,
Macherey-Nagel C18谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)为固定相,柱温25 ℃,流速1.0 mL/min,波长435 nm,进样量20 μL.结果显示,10种素的线性范围为0.25~160.0 μg/mL,饮料、糖果、糕点样品中各素的加标回收率分别在88.0%~103.6%、88.0%~98.3%、81.4%~106.7%之间.该方法重现性好,灵敏度和准确度高,适用于食品中该10种黄素的分析.
【期刊名称】《四川师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2016(039)006
【总页数】5页(P895-899)
【关键词】食用素;非食用素;高效液相谱
【作 者】李小云;赵喜玲;李琪;宋丹萍;曾慧;张宏
【作者单位】四川师范大学 化学与材料科学学院, 四川 成都 610066;四川师范大学 化学与材料科学学院, 四川 成都 610066;四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101;四川师范大学 植物资源开发与应用研究所, 四川 成都 610101;四川省眉山市动物疾病控制中心, 四川 眉
山 620010;四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101;四川师范大学 化学与材料科学学院, 四川 成都 610066;四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.72
在食品加工业中通常加入各种素以提高食品的泽,增加食欲.素按其用途可分为食用素和非食用素.大部分食品中使用较多的是黄素.素使用过程中添加过量、违规添加等现象时有发生,某些素过量摄入会危害健康[1].因此,食品中素的分析测定显得尤为重要.
素的检测方法主要是液相谱法[2-4]以及液相谱-质谱联用(LC-MS)[5-6].N. Yoshioka等[7]报道了食品中合成素的检测方法,其中大部分为非食用素.目前检测食品中合成素的国家标准,基本以聚酰胺吸附法为样品前处理方法[8-9],而非食用素的检测尚未有较为全面的国家标准.由于国家标准方法《食品中禁用物质的检测——碱性橙染料》[10]仅规定了碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22的分析测定;因此,针对非食用素的分析检测还不完善.文献报道的素处理方法较为繁杂,而能将样品前处理简单化,并且能同时检测含有天然素、合成
素和非食用黄素的液相谱方法研究较少.本文将允许添加的合成黄素柠檬黄、日落黄以及喹啉黄、天然素姜黄素和非食用素酸性间胺黄、碱性嫩黄O、碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙Ⅱ等10种黄素作为研究对象,建立一种能同时检测多种素的高效液相谱法.
1.1 试剂与仪器 柠檬黄(CAS:1934-21-0)、日落黄(CAS:2783-94-0)、酸性间胺黄(CAS:587-98-4)均购于AccuStandard公司,喹啉黄(CAS:8004-92-0)、姜黄素(CAS:458-37-7)、酸性橙Ⅱ(CAS:633-96-5)、碱性嫩黄O(CAS:2465-27-2)均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司,碱性橙2(CAS:532-82-1)、碱性橙21(CAS:3056-93-7)、碱性橙22(CAS:4657-00-5)购于北京振翔工贸有限公司,甲醇、乙腈(均为谱纯)购于美国BRC公司,其余试剂(分析纯)购于科密欧试剂有限公司.
PDA-100液相谱仪(美国戴安公司),Direct-Q 5型超纯水仪(美国Millipore公司),Buchi R-3型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),BP211D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司).
1.2 谱条件 谱柱:Macherey-Nagel C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);进样量:20 μL;柱温:25 ℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:435 nm;流动相:甲醇(A)、0.02 mol/L乙酸铵溶液(B)、乙腈(C);
各流动相梯度洗脱的体积分数见表1.
1.3 实验方法
1.3.1 标准品溶液制备 准确称取各素标准品50.0 mg于25 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容,作为质量浓度为2.0 mg/mL的各单素标准储备液,待用.取各单标素的标准储备液4 mL至50 mL容量瓶,甲醇定容,得到质量浓度160 μg/mL混合储备液,待用.
1.3.2 样品溶液制备 称取饮料样品20.0 g,旋至近干,加入20 mL甲醇,超声20 min,离心15 min,取上层清液旋蒸至近干,甲醇定容至10 mL,溶液过0.45 μm滤膜,待测.
糖果样品称取2.5 g,超纯水加热溶解后,加入10 mL甲醇,超声30 min,离心15 min,取上层清液,剩余残渣重复上述操作1次,合并2次提取液旋蒸至近干,甲醇定容至20 mL,溶液过0.45 μm滤膜,待测.
糕点、冰淇淋样品称取2.5 g,先加入10 mL石油醚,充分搅拌后倒出溶液,再向残渣加入5 mL石油醚,搅拌后除去油脂干燥.再向样品中加入30 mL甲醇,超声20 min,离心15 min,取上层清液,剩余残渣重复上述操作2次,合并3次提取液旋蒸至近干,甲醇定容至10 mL,溶液过0.45 μm滤膜,
待测.
1.3.3 线性范围的建立 取一定体积的混标储备液分别配制成质量浓度为0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100.0、160.0 μg/mL的混合标准液,在1.2谱条件下进行分别测定.
1.3.4 精密度的考察 分别取0.25、10和100 μg/mL低、中、高3个质量浓度混合标准溶液按1.2项下谱条件连续平行测定6次.
1.3.5 稳定性的考察 饮料、糖果和糕点样品各取1份,分别加入低质量浓度0.25 μg/mL混标液,样品按1.3.2项方法处理后,按1.2所述谱条件分别在0、6、12、24和48 h进样分析.
1.3.6 重现性的考察 各取饮料、糖果和糕点样品6份,分别加入质量浓度0.25 μg/mL的混合标液,按1.3.2项方法制备样品溶液,按1.2项谱条件进行分析,测定峰面积,计算出10种素的质量浓度及RSD值.
1.3.7 回收率的测定 分别称取9份饮料样品20.0 g、糖果样品2.5 g和糕点样品2.5 g,根据1.3.2项样品处理,饮料、糖果和糕点样品中添加0.25、10和40 μg/mL的低、中、高3个质量浓度的
混合标准工作液.按1.2项谱条件测定,计算9次的平均回收率.
1.4 样品的测定 分别准确称取2.50 g的糖果和糕点样品,称取20.0 g饮料样品.按1.3.2所述的前处理方法和1.2所述谱条件对样品进行提取和谱分析.
2.1 谱条件的确定
2.1.1 检测波长的选择 分别对10种素在波长190～800 nm范围内采集紫外光谱图,其中日落黄、酸性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22等4种素的最大吸收波长在490 nm左右,同时在430 nm左右也都有一定的紫外吸收,其余6种素的最大吸收波长均在430 nm左右,综合各种素的最大吸收波长,最后选择435 nm作为检测波长,在此波长下每个素均能被检测.
2.1.2 流动相的选择 试验选择比较了甲醇-水体系、甲醇-缓冲盐体系共5种溶液.结果发现:流动相仅使用甲醇-水溶液时,10种素很难完全分离;使用甲醇-乙酸铵溶液作为流动相时,10种素能实现基本分离;但碱性橙21、酸性橙Ⅱ和碱性橙2等3种素保留时间较接近.当加入少量乙腈时,分离效果更好,碱性橙21和酸性橙Ⅱ能实现完全分离.故选择甲醇-乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液组成流动相体系.
buchi
2.1.3 pH的选择 试验分别比较了10种素在pH=5.0、7.1、5.8时的分离情况.结果表明:在pH=5.8时,10种组分分离效果较理想;在pH=5.0时,日落黄、柠檬黄不能被很好地洗脱下来,部分谱峰完全重叠;在pH=7.1时,喹啉黄与杂质峰完全重叠,碱性嫩黄O与碱性橙21、碱性橙21与酸性橙Ⅱ、碱性橙22与姜黄素不能达到完全分离.故选取pH=5.8的0.02 mol/L乙酸铵溶液.
2.1.4 流速的选择 试验分别考察流速为0.8、1.0、1.2 mL/min时10种混合标准物质的出峰情况.当流速为0.8 mL/min时,碱性橙21和酸性橙Ⅱ之间未能实现完全分离;流速为1.0 mL/min时,各组分之间均能实现完全分离,且分离度大于1.5;流速为1.2 mL/min时,碱性橙21和酸性橙Ⅱ分离度未达到1.5以上.综合考虑最终确定流速为1.0 mL/min.
2.1.5 柱温的选择 本试验分别考察了20、25、30 ℃对10种素分离情况的影响.结果表明:柱温在20 ℃时酸性橙Ⅱ和碱性橙2分离度未能达到1.5以上.柱温为25 ℃时,各组分均能实现完全分离,分离度在1.6以上.柱温在30 ℃时,碱性橙21与酸性橙Ⅱ谱峰完全重叠,碱性橙2包含杂质峰.综合考虑选择最适宜的柱温为25 ℃.
2.2 方法学的验证
2.2.1 线性范围的建立 在选定的最佳条件下,10种素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)见表2.该10种素在质量浓度0.25～160 μg/mL范围内线性关系良好.