中P兽医科学 2021，51(02):257-262
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-11-24 DOI：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0014 中图分类号：S853.7 文献标志码：A文章编号：1673_4696 (2021)02-0257-06黑种草子总皂苷和总黄酮提取工艺优化
郭燕飞1，孙耀贵1，孙娜1，孙盼盼2，李宏全1*
(1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801:2.山西农业大学实验动物中心，山西太谷030801)
摘要：为了优选能同时提取黑种草子中的总皂苷和总黄酮的提取工艺，采用L9(34)正交试验法，通过考 察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数，以总皂苷和总黄酮含量为工艺选择的评价指标，进行了黑种草子提取工艺的研究。结果表明，最佳提取工艺为8倍量的60%乙醇回流提取2次，每次l h。该提取工艺稳定可行，可用于黑种草子总皂苷和总黄酮的同时提取。
关键词：黑种草子；提取工艺；总皂苷；总黄酮
Optimization of extraction technology for total saponins and total
flavonoids from Nigellae semen
GUO Yan-fei1，SUN Yao-gui1，SUN Na1，SUN Pan-pan2, L I Hong-quan1*
(1. College of Veterinary Medicine .Shanxi Agricultural University ,Taigu030801 ,China ；2. Laboratory Animal Center,
Shanxi Agricultural University ,Taigu030801 .China)
Abstract：In order to optimize the extraction technology of the to tal saponins and to tal flavones from Nigellae semen.The L g(34)orthogonal te s t was used to study the extraction technology of Nigellae semen by investigating the ethanol concentration,amount of ethanol and extraction times,and the content of to tal saponins and to tal flavones as the evaluation indexes for process selection.The resu lts showed that the optimal extraction technology was8 times of60%ethanol reflux extraction for 2 times,1h each time.The extraction technology is stable and feasible that can be used to simultaneous extract to tal saponins and to tal flavonoids from Nigellae semen.
Keywords:Nigellae semen；extraction technology；to tal saponins；to tal flavonoids
* Corresponding author：LI Hong-quan,E-mail：liv e ts@163. com
黑种草子（Mge/iae semen)是历版《中华人民共 和国药典》收载的中药品种，为毛茛科植物腺毛黑种
草（Mge/〗a g〗andu/;_fera Freyn et Sint)的干燥成熟种 子，性温，味甘、辛，有补肾健脑、通经、通乳、利尿等 功效[1]。现代药理研究表明黑种草子也有镇咳、平 喘、抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节等作用>3]。黑种草 子含有油脂、挥发油、皂苷类、黄酮类、生物碱等成 分，其中皂苷及黄酮类化合物是其主要有效成分，含量较高，药用价值大:1_5:，但在动物养殖业中的应用 研究鲜有报道。为了将其开发为天然植物饲料原料 及植物提取物饲料添加剂，本试验采用L9(34)正交 试验法，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次 数为考察因素，进行了黑种草子的提取工艺研究，并 通过同时测定总提取物中总皂苷和总黄酮含量为质 控指标，优选出了能同时提取这两类成分的工艺，为进一步开发利用提供依据。
收稿日期：2020-10-18；修回日期：2020-11-21
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0501500)；山西省重点研发计划项目（201803D221023-3)
作者简介：郭燕飞（1996-)，女，山西陵川人，硕士生，研究方向为中药活性成分及其作用机制，Tel*************,E-mail: *****************。*通讯作者：李宏全（1963-)，男，山西汾阳人，教授，博士，主要研究方向为中药活性成分 及其作用机制，Tel:************,E-mail:livets@ 163。
258中国兽眹科学第51卷
1仪器与试药
1.1仪器
UV—2800型双光束紫外可见分光光度计为上 海奥普勒仪器有限公司产品。FW177型中草药粉碎 机由天津市泰斯特仪器有限公司生产。SB25—12D 超声波清洗机为宁波新芝生物科技股份有限公司产 品。SJIN—10N冷冻干燥机产自宁波市鄞州双嘉仪 器有限公司。TB—215D电子分析天平为赛多利斯 天平有限公司产品。B—491旋转蒸发仪为瑞士BUCHI公司产品。HH—56数显恒温水浴锅产自江 苏金坛市金城国胜实验仪器厂。
1.2试剂
常春藤皂苷元对照品（批号111733-201205)和芦丁对照品（批号100080- 201811)购自中国食品药 品检定研究院。无水乙醇、正丁醇、甲醇、石油醚 (60〜90)、冰醋酸、香草醛、盐酸、高氯酸、无水三氯 化铝试剂均为分析纯。
1.3黑种草子
黑种草子购于新疆本草堂中药饮片公司。前处 理：取适量黑种草子药材粉碎，过40目筛，加人10 倍量的石油醚（60〜90)，超声2次脱脂，每次1h。抽滤，用旋转蒸发仪回收石油醚，滤渣水浴挥干，避 光
条件下保存[6]。
2方法与结果
2.1总提取物的制备
精确称取50 g黑种草子粉末，脱脂，置于1000 m L圆底烧瓶中，加入60%的乙醇400 mL，水浴回 流提取2次，每次1h，抽滤，将提取液合并，用旋转 蒸发仪浓缩提取液，并回收乙醇，将浓缩后的提取液 转移至蒸发皿，减压冷冻干燥24 h。
2.2总皂苷含量的测定
2.2.1对照品溶液的制备精密称取常春藤皂苷 元对照品适量，加甲醇溶解，制成0.1 mg/mL的对照品溶液
2.2.2供试品溶液a的制备精确称取0.1 g冷冻 干燥后的样品，量取10 mL蒸馏水在烧杯中溶解样 品，转移到分液漏斗，加水饱和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并3次正丁醇液，水浴蒸干后加适量 甲醇溶解，转移至l〇mL容量瓶中定容，摇匀，作为 供试品溶液a。
2.2.3线性关系考察精密吸取上述对照品溶液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.41：1匕，力|1至251111具塞试管中，水浴，使溶剂挥发完全。在试管中加人0.2 mL5%香 草醛-冰乙酸溶液，溶解后加0.8 mL高氯酸，
摇匀，密封试管，60 °C水浴条件下放置15 min,2 min冰水 浴，加冰乙酸5.0 mL，摇匀，随行试剂作对照，于545 nm波长处测定吸光度以常春藤皂苷元质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，得回归方 程 y=2.949 8；*+0.037 9，/?=0.999 1，结果得出常 春藤皂苷元在0.04〜0.24 mg之间与吸光值有良好 的线性关系。
2.2.4精密度试验精密吸取6份0.1 m L的供试 品溶液a，按“2.2.3”的方法进行显，于545 nm波 长处测量吸光度。结果显示，吸光度的RSD值为 0.83%，表明该法精密度良好。
2.2.5稳定性试验精密吸取0.1 mL供试品溶液 a，按“2.2.3”的方法进行显，分别于0、10、20、30、45、60min时测定吸光度，计算的RSD值为1.31%，表明供试品显后1h以内稳定性良好。
2.2.6重复性试验准确称取50 g样品6份，进行 水浴回流提取，按“2.2.2”的方法平行配制6份供试 品溶液a，每份取0.1 m L于25 m L具塞试管中，按 “2.2.3”的方法显，测定其吸光度，并计算黑种草 子总皂苷提取量。结果显示，总皂苷的平均含量为 28.776 7 mg/g，RSD值为1.07%，表明本方法重复性 良好。
2.2.7 加样回收率试验精确量取6份0.1 m L已知含量的黑种草子供试品溶液a加到具塞试管中，
表1加样回收率试验
Table 1The results of average recovery rate
序号样品量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%R S D/%
Serial number Sample content Add amount Detectable amount Recovery rate Average recovery rate Relative standard deviation 10. 128 00. 100 00.227 199. 14
20. 128 00. 100 00.228 4100. 37
30. 128 00. 100 00. 226 698. 58
99.60  1.43
40. 128 00. 100 00. 227 699.60
50. 128 00. 100 00. 226 097.96
60.128 00. 100 00. 230 0101.96
第2期郭燕飞等：黑种草子总皂苷和总黄酮提取工艺优化259
分别精确加人常春藤皂苷元对照品溶液0.5 mL，按 “2.2.3”的方法进行显，对吸光度进行测定，计算 回收率、平均回收率以及RSD值，结果见表1。
2.3总黄酮含量的测定
2.3.1对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品 适量，加甲醇溶解，制成0.25 mg/mL的对照品溶液。
2.3.2供试品溶液b的制备精确称取0.1 g冷冻 干燥后的样品，加5 m L甲醇溶解，转移至10 mL容 量瓶中定容，摇匀，作为供试品溶液b。
2.3.3线性关系考察精密吸取“2.3.1”制备的对 照品溶液 〇_1、0.2、0.4、0.6、0_8、1.0mL，置于 5 mL容量 瓶中，加人2mL2%的A1C13甲醇溶液和0.05m L的HC1，加甲醇定容，摇匀、避光显40 min，在405 nm 波长处测定吸光度，以不加HC1和A1C13溶液的空白 试剂作对照[61。以芦丁质量（m g)为横坐标，吸光度 为纵坐标进行线性回归，得回归方程y=5.559 3x+ 0.033 9，硭=0.999 7，结果得出常春藤皂苷元在0.025〜0.250 mg之间与吸光值有良好的线性关系。
2.3.4精密度试验精密吸取6份0.5 m L的供试 品溶液b，按“2.3.3”的方法进行显，于405 nm波 长处测量吸光度。结果显示，吸光度的RSD值为
1.02%，表明该法精密度良好。
2.3.5稳定性试验精密吸取0.5 m L的供试品溶 液b，按“2.3.3”的方法进行显，分别于0、10、20、30、45、60min时测定吸光度，计算的RSD值为2.27%，表明供试品显后1h以内稳定性良好。
2.3.6重复性试验准确称取50 g样品6份，进行水浴回流提取，按“2.3.2”的方法平行配制6份供试 品溶液b，每份取0.5 mL于5 mL容量瓶中，按“2.3.3”的方法显，测定其吸光度，并计算黑种草子总黄酮 提取量。结果显示，总黄酮的平均含量为2.446 mg/g, RSD值为2.29%，表明本方法重复性良好。
2.3.7 加样回收率试验精确吸取6份0.5 m L已知含量的黑种草子供试品溶液b加到容量瓶中，分 别精确加人芦丁对照品溶液0.2 mL，按“2.3.3”的方 法进行显，对吸光度进行测定，计算回收率、平均 回收率以及RSD值，结果见表2。
2.4黑种草子总提取物提取工艺的优化
2.4.1正交试验采用L9(34)正交试验法，以总皂 苷和总黄酮含量为测定指标，考察乙醇浓度、乙醇用 量、提取时间和提取次数对提取效果的影响，因素与 水平见表3。按正交试验表中条件(表4)，称取9份 样品，每份50 g，置于1 000 mL容量瓶中进行水浴 回流提取，抽滤，浓缩，冷冻干燥，得黑种草子总提取 物，用“2.2”和“2.3”的方法测定总皂苷和总黄酮含 量。正交试验结果见表4，方差分析结果见表5、表6。
以黑种草子总皂苷含量作为考察指标，对数据 进行方差分析（表5)可知，A、B、C、D四个因素均对 总皂苷的提取量有显著影响（P<0.01)；根据极差 (表4)可知，A因素的2水平优于1、3水平，故选A2;B 因素的1和3水平无差异，均优于2水平，故选Bl;C 因素的1和2水平无差异，且均优于3水平，故选C,; D因
素的3水平优于1、2水平，故选D3。因此提取总 皂苷的最优条件为A B C P s。以黑种草子中总黄酮
表2加样回收率试验
Table 2 The results of average recovery rate
序号
S e ria l number
样品量/mg
Sample content
加人量/mg
Add amount
测得量/mg
D etectable amount
回收率/%
Recovery ra te
平均回收率/%
Average recovery ra te
RSD/%
R elativ e standard d e v ia tio n
10. 109 30. 050 00. 156 594.30
20. 109 30. 050 00. 156 494. 06
30. 109 30. 050 00. 156 293.67
93. 47  1.04 40. 109 30. 050 00.156 193. 60
50. 109 30. 050 00. 156 193.61
60. 109 30. 050 00. 155 191.58
表3正交因素水平L9(34)表
Table 3 Factors and levels of L9(34)orthogonal test
水平Levels
因素Factor
A(乙醇浓度/%)
Ethanol co n cen tratio n
B(加入溶剂量/倍）
Amount of ethanol
C(提取时间/h)
E x tra ctio n time
D(提取次数/次）
E x tractio n tim es
1308  1.01 26010  1.52 39012  2.03
260中国兽医科学第51卷
表4提取工艺正交试验结果
Table 4 The results of orthogonal test of extraction technology
组分试验号1234总皂苷含量/(m g_g〇总黄酮含量/(m g〇Component Numbers A B C D Content o f to ta l saponins Content of to ta l flavonoids 1111117.94  1.40
2 122218.31  1.50
3 133322.91  1. 50
4 212354.90  2. 05
5 223131.5
6  1.88
6 231250.79  2. 16
7 313234. 63  2.83
8 321341.20  2.98
9 332135. 43  2.74
kl 59.15107.47109.9284.93
总阜苷 T otal saponins k2 137.2591.07108.64103.73
k3 111.27109.1389. 10119.01
R78.1118. 0620.8234.08
kl    4.40  6. 28  6. 53  6.02
总黄酮 T otal flavonoids k2    6.09  6. 36  6.30  6. 49
k3 8.55  6. 39  6.21  6.52
R  4. 160. 120.320.51
表5方差分析
Table 5 Variance analysis
方差来源平方和自由度均方f•值P值Source Sun of squares Degree of freedom Mean square F value P value
A  2 108. 89421054. 4471064. 925<0.01
B132.818266. 40967.069<0• 01
C181.579290.78991.692<0. 01
D388.4162194.208196.138<0.01
误差 D eviation8.91190.990
F 0.01(2,9)=8.02.
表6方差分析表
Table 6 Variance analysis
方差来源平方和自由度均方F值P值Source Sun o f squares Degree o f freedom Mean square Fvalue P value
A  5.8382  2.919261.658<0.01
B0.00520.0020.204>0. 05
C0.03620.018  1.614>0.05
D0. 10820.054  4.841<0.05
误差D eviation0. 10090. Oil
F 0.01 (2,9)=8.02, F 0.05 (2,9) =4.26.
含量为考察指标，对数据进行方差分析（表6)可知，因素A和D对总黄酮提取结果有显著影响(P<0.05)；根据极差(表4)可知，A因素的3水平优于1、2水 平，故选A3;B因素和C因素的各水平间无差异，为节约
成本和时间，故选B，和C,;D因素的2和3水平间无差异，且均优于1水平，故选D2。因此提取总 黄酮的最优条件为A P f P e。综合考虑黑种草子提取物中总皂苷和总黄酮含量的占比、后续产业化能 耗及用时，最终确定了黑种草子总提取物的最佳提 取工艺为，即8倍量的60%乙醇水浴回流 提取2次，每次1h。
2.4.2验证试验精确称取黑种草子粉末3份，每 份50 g，按优选出的最佳工艺条件进行试验，结果见 表7 ：由表7可知，优化所得工艺条件稳定可行。
第2期郭燕飞等：黑种草子总皂苷和总黄酮提取工艺优化261
表7验证试验结果
Table 7 Verification test results
"i i总皂苷含量A m g j1) 平均含量/(mg*g—D总黄酮含量/(mg*g 一D平均含量乃
S e ria l number Content of to ta l saponins Average content Content of to ta l flavonoids Average content 148.29    2.32
2 49.90 49.39    2.30    2.29
3 49.98    2.26
3讨论
目前有关黑种草子提取工艺的研究均以总皂背 或总黄酮等单一活性组分的获得为目标，以总皂苷 或总黄酮的得率为评价指标。史荣梅等:8：采用星点 设计-效应面法对瘤果黑种草子总皂苷提取工艺进 行研究，对提取工艺的乙醇浓度、溶媒量、超声温度 和时间进行了考察，确定工艺为12倍量50%的乙 醇60 °C超声提取90 min；金蕾明等^采用正交法对 瘤果黑种草子总皂苷提取工艺进行研究，对提取工 艺的乙醇浓度、溶媒量、提取温度和提取次数进行了 考察，确定工艺为8倍量30%的乙醇70 °C回流提取 3次；曹莹粲等采用超声辅助的方法对黑种草子中 总黄酮的提取工艺进行研究，对提取工艺的甲醇浓 度、溶媒量、超声温度和时间进行了考察，确定工艺 为24倍量63%的甲醇62 °C超声提取50 min；肖琼 等％采用正交法对瘤果黑种草子总黄酮的提取工艺 进行研究，对提取工艺的乙醇浓度、溶媒量和提取时 间进行了考察，确定工艺为16倍量60%的乙醇提2 次，每次1h。
目前，中药提取物的工业化生产工艺中所采用 的溶媒主要为水和乙醇。本研究最终确定了黑种草 子的提取溶媒为60%的乙醇，从成本控制的角度来 说，似乎比以水为溶媒进行提取的成本高，但是保证 了提取物中有效成份的含量，而且在对提取物进行 减压浓缩的过程中可以对乙醇进行回收，从而实现 对乙醇的循环利用。此外，以60%乙醇作为溶媒进 行提取，生产过程中的安全性较高，符合工业化大生 产的安全要求。
以单一活性组分为目标进行提取存在药材中其 他活性组分的浪费问题，而不同组分的分别提取又 存在着工艺复杂、耗时较长、试剂与耗材的用量大等 问题，因此在控制和评价中药质量时，多种指标成分 同时测定比单一指标更科学[11]。近年来，从单味中 药(如甘草、威灵仙、藤三七、刺五加、女贞叶等）中同 时提取总皂苷和总黄酮的研究得到了尝试。为此，本试验首次开展了黑种草子中总皂苷和总黄酮 同时提取的工艺优化研究，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为考察因素，以提取物中总黄酮
含量和总皂苷含量为评价指标，设计L9(34)正交试
验优化提取条件，最终确定黑种草子总提取物的最
佳提取工艺为8倍量的60%乙醇水浴回流提取2 次，每次1h，此条件下黑种草子总皂苷提取量为49.39 mg/g，总黄酮提取量为2.29mg/g。验证试验证明该提
取工艺稳定可行，可用于黑种草子中总皂苷和总黄酮
的同时提取，为黑种草子的开发利用提供了依据。
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