李军12梁永平1邹胜章1周长松1樊连杰13!缪雄谊1谢浩1（1中国地质科学院岩溶地质研究所，自然资源部/广西岩溶动力学重点实验室，广西桂林541004；
2.河北建筑工程学院，河北省水质工程与水资源综合利用重点实验室，河北张家口075000；
3.桂林理工大学环境科学与工程学院，广西桂林541006）
摘要地下水污染是全球普遍关注的环境问题之一，地下水环境特殊性和污染物复杂性加大了地下水污染修复难度。微生物修复是以微生物自身代谢功能为基础的一种修复方法，相对其他技术具有成本低、对环境扰动小等优点，在地下水污染长期修复中优势明显#系统总结了监测自然衰减的微生物证据、室内自然衰减模拟与定量检测技术以及生物刺激修复中关键环境因素的调控方法，介绍了地下水中无机氮、有机物和金属元素3类常见污染物的微生物修复研究进展，提出了微生物修复地下水污染中急需解决的关键问题，以期为地下水污染的微生物修复研究提供新思路#
关键词地下水污染微生物自然衰减生物刺激
DO#1015985/jcnki1001-3865202105020
Research progress on application of microorganism in groundwater pollution remediation LI Jun1",LIANG Yongping1,ZOU Shengzhang',ZHOU Chang s ong1,FAN Lianjie1,3,MIAO Xiong y i,XIE Hao1.(1.Key Laboratory of Karst Dynamics■,Ministry of Natural Resources/Guangxi,Institute of Karst Geology,Chinese Academy of Geological Sciences?Guilin Guangxi541004；2.Hebii Key Laboratory of Water Quality Engineering and Comprehensive Utilization of Water Resources,Hebei University of Architecture,Zhangjiakou Hebei075000；
3.School of Environmental Science&Engineering,Guilin University of Technology,Guilin Guangxi541006)
Abstract:Groundwater pollution,as one of the environmental issues,has been widely concerned around the world Complexityofcontaminantsandparticularityofgroundwaterenvironmentmakeitmoredi f iculttoremediate groundwaterpo l ution Bioremediation technology based on the function of microbial metabolism is one ofthe promising technologies for long-term remediation due to its advantages of the low cost and less perturbation to environment This article systematica l y summarized microbialevidences of monitoring natural a t enuation and technology of indoor natural attenuation simulation and quantitative detection for natural attenuation ,and regulation methodofcrucialenvironmentforbiostimulationremediation Theapplicationprogressofmicrobiologicalre
mediation forinorganicnitrogenorganicma t erandmeta l icelementingroundwaterwasalsointroduced In addition key issues urgentlyrequiredtobesolvedin microbiological remediation of groundwater po l ution were proposed and there were expected to provide a new reference for research on microorganism remediation of groundwater contamination Keywords:ground w ater；contamination；microbiology；natural attenuation；biostimulation
微生物修复是指利用天然存在的或可培养的功能微生物菌在适宜环境条件下通过自身代谢作用，将污染物降解成无毒或低毒物质的一种修复技术。目前，地下水的微生物修复研究主要包括自然衰减修复和生物刺激修复。自然衰减修复是指地下水中天然存在的微生物通过代谢作用在合理时间段内实现污染物浓度和总量的减少閃，当自然衰减不足以应对污染场地修复要求时，就需人为添加修复剂或功能菌进行环境调控，即生物刺激修复。生物刺激修复通过向污染地下水中添加修复剂，为功能菌提供足够的营养物质、能量和电子等以达到污染物快速降解的目的卩6*。
地下水中污染物种类复杂，污染物的化学性质不同，微生物降解转化机理也不相同［7］35#三氮（NO］、NO］、NH+）污染是地下水常见的污染物之一，美国高平原、印度北部和我国华北平原集约化农业区地下水均有较严重的NO］污染归针对无机氮污染，微生物作用的关键过程是反硝化作用，反
第一作者：李军，男1990年生，硕士，助教，主要从事地下水污染和环境微生物研究.*通讯作者#
"国家重点研发计划项目（No.2017YFC0406104）；广西科技计划项目（No.桂科AB18050026）；中国地质调查局基本科研业务费专项（No. JYYWF20182001）#
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硝化细菌利用NO］和NO］作为呼吸过程的电子受体，最终把硝酸盐还原成NJ911*。地下水中有机物种类远比其他污染物多，但其浓度往往较低，微生物通常将地下水中的有机物作为能量和营养物质，通过生长代谢、共代谢过程直接或间接对其进行利用，经开环、脱氯、脱氮、氧化、还原等作用最终被降解为碳、水物质#Cr、Cd、Hg、As、Pd、Mn是地下水中较为常见的重金属元素，地下水中重金属浓度通常较低，但毒性较大#微生物一般不能直接利用重金属物质，但可通过氧化、还原、甲基化和去甲基化等作用改变重金属价态，或者对其进行固定，实现低毒或无毒转化微生物修复技术相对经济，对环境扰动小［14］11871192，是地下水污染修复具有潜力的方法之一。
本研究重点介绍微生物在地下水污染自然衰减修复和生物刺激修复中的关键问题和研究进展，特别是针对地下水不同类型污染物特点的修复研究，以期为地下水污染修复的基础研究和实际应用提供新思路。
1自然衰减修复
自然衰减修复的目的是在绿修复理念基础上将地下水中污染物的数量、可移动性、毒性降低到可接受风险水平，该修复过程相对其他修复工程，除必要的污染地下水体控制、微生物和污染物监测与评价以外，无需实施人为工程#目前，监测自然衰减（MNA）是国际上应用比较广泛的一种自然衰减修复技术研究方法，但由于早期分子生物学技术的限制，多数研究停留在对污染物质量和环境地球化学信息方面的检测上#现代分子生物学和生物信息学快速发展，为揭示MNA的高级证据微生物提供支撑#利用现代分子生物学技术检测微生物菌，揭示地下水中污染物自然衰减过程和功能菌特征，以明确自然衰减机理，评估自然衰减能力#通常监测自然衰减方法包括污染地下水的原位微生物检测和室内自然衰减模拟与定量检测［141190#
15原位微生物检测
地下水污染物无害化自然降解过程中，必须要有能够降解目标污染物的微生物菌［15］，因此原位微生物检测是证明自然衰减能力的重要方法#多数情况下，原位微生物检测并不是在污染场地直接进行微生物定量检测分析，通常需采集样品及时送往实验室进行检测分析，该过程很大程度上依赖现代分子生物学技术和生物信息学分析水平#微生物多样性与组成方面，通过对16S rRNA扩增子测序，揭示降解污染物的功能菌的存在及其丰度，可直接说明微生物具有降解污染物的潜力［16137#同时，污染区微生物菌多样性差异也能反映出污染物对微生物落结构产生的影响［17］，已有研究表明，污染物的存在会强化部分菌，导致污染区微生物落多样性通常较非污染区偏低）9*；功能基因方
面，利用宏基因组测序不仅可揭示与污染物转化相关功能基因信息）0*，而且可预测菌相关代谢潜力皿*。此外，功能基因芯片也可直接揭示污染地下水中功能基因组成与结构以及代谢潜力［22］，但该技术并不能发现未知的功能基因；关键菌和功能基因的存在只能说明微生物具有降解污染物的潜力，并不能说明基因表达情况，从环境微生物mRNA入手进行宏转录组研究，可揭示污染地下水体中功能基因的表达情况和表达差异，从转录水平为自然衰减提供微生物代谢活动和驱动生物地球化学循环的证据#此外，由于地下水样品运输、保存等过程并不能实现真正意义上的现场检测，CHANDLER等将DNA扩增、标记、杂交步骤整合为一体，设计出一款单步的微流体装置，即放大的便携式生物芯片，可用于污染地下水的微生物原位检测，但该技术相对室内检测通量较低，也不能检测出未知的微生物信息# 15室内自然衰减模拟与定量检测
室内模拟相对天然地下水系统，水文地质条件更易控制，地下水污染状态更易调节，污染物自然衰减、微生物菌变化更易监测和定量分析，这有利于地下水污染物自然衰减的跟踪研究和定量化评估目前，室内模拟地下水污染自然衰减常用的装置包括砂箱和砂柱2种，砂箱模拟一般多用于污染物持续性的自然衰减监测，实验周期通常较长而砂柱模拟常用于揭示单一变量对自然衰减的影响，在控制变量条件下，往往需要利用多组砂柱来设置变量的梯度差异）5*#室内自然衰减模拟装置中降解污染物的功能菌可来源于原始污染的地下水，即土著微生物，也可采集其他菌物质或投放专门经培养驯化的外源功能菌#
检测进出水污染物浓度变化是判断模拟装置自然衰减能力和衰减持续时间最直接的手段，而揭示污染物自然衰减机制需要从微生物菌的角度出发#除原位微生物检测常用的分子生物学技术外，对微生物特定物质（如核酸序列、多肽、蛋白质等）进行标记，能较好地跟踪污染物自身降解过程和与污染物降解过程的相关微生物活动；应用荧光定量聚
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合酶链式反应（qPCR ）技术可识别与污染物转化相 关的功能基因的存在与数量，该技术受引物数量限
制，并不能一次检测多个基因，但定量检测特定的基 因较为实用；此外，今后有可能通过基因工程技术构 建降解能力和适应能力更强的工程菌，可进一步在
地下水污染模型中进行菌降解能力的评价［26］，有 利于更好地发挥微生物在修复地下水污染中的 作用#
2生物刺激修复
生物刺激修复通常从两方面入手，一方面向污 染地下水中添加修复剂，通过环境调控来提高土著 微生物降解污染物的能力；另一方面向污染地下水
中添加经实验室驯化的功能菌来降解污染物#相
对土壤而言，向地下水中添加功能菌的应用明显 较少#地下水环境具有无光、低温、低氧等特点，是
一个近似极端的环境，外源菌在污染地下水中 的存活难度、降解污染物的效率和时效性等不易保
证#而土著微生物在污染地下水中本身已具有较强 的适应能力，相对而言，温度、pH 等多数环境因子并
不需要过多人工调控，因此，多数研究集中在尽可能 不改变地下水环境下如何刺激土著微生物降解污染
物方面。
2.1 添加剂选取
添加剂一般为微生物代谢必需的营养、能量和 代谢过程所需的电子受供体等物质，通过强化微生 物代谢能力和菌丰度，以加速污染物的降解、转化 作用#添加剂选取需符合一定要求：不应对生命体
和环境产生毒害作用；对地下水环境的改变尽可能
小；能够为微生物功能菌提供较多营养、能量和电 子等#目前常用的添加剂信息详见表1。多数添加
剂相对环保，为对生命体无毒害作用的有机物，同时
在地下水中具有良好的迁移性#但针对高锰酸钠这 类具有强氧化性的添加剂，其本身具有一定的杀菌 作用，使用时应结合地下水污染的具体情况综合 考虑。
2.2 溶解氧（DO ）调节
地下水DO 与气压、水温、水质关系密切，同时 还受水体中微生物数量、有机物浓度等综合影响，通
常地下水DO 不超过纯水（9 mg/L ）。微生物可分 为好氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生物，其代
谢过程和代谢速率存在较大差异。适量、充足的氧 气是原位好氧微生物修复污染水体的关键所在，通 常可通过人工曝气和添加释氧剂增加地下水含氧
量。人工曝气方法在地下水污染修复中应用较早， 但其施工量较大。部分研究尝试用H 2O 2作为地下 水释氧剂，而H 2O 2释放氧气过程仅能持续几分钟到
几小时，同时，其强氧化性容易导致土著微生物失活 而降低污染修复效果。目前使用较多的是固相氧气
缓慢释放剂（ORC ），常用的ORC 有CaO 2,MgO 2和
NaCO s，其中，CaO z 在地下水中生物刺激修复中应
用较多，因为CaO 2释放氧气时间较长，持续释放时 间一般介于6个月至1年以上阴*
，可为地下水好氧
微生物降解作用持续供氧。CaO 2投放到地下水中
发生如下反应）9* :
CaO 2+2H 2O —H 2O 2+Ca(OH )2
(1 )
2H 2O 22H 2O+O 2
2)
H 2O 2+e ]—OH + OH ](3 )
地下水常用增氧方法见表2。
3微生物在地下水污染修复中的应用
地下水中常见污染物通常可划分为无机氮、有 机物和金属元素3大类，微生物对不同类型污染物 的修复过程不同，其修复方法的选择存在一定差异。
表1生物刺激修复中常用的添加剂
Table1 Commonlyadditivesusedinbiostimulation
添加剂
化学式或主要成分
目标污染物
主要作用
文献
甲醇、乙醇CH 3OH 、
C 2H 7OH
NOa
为异养反硝化细菌提供碳源，同时可作为电子供体
)8*
乳化植物油（EVO ）大豆植物油
具有较好的迁移性，能够长期为微生物提供碳源和 电子供体
)9*、30*
释氢化合物（HRC ）
甘油聚乳酸
Cr(
*)水合作用下，HRC 释放乳酸，为微生物提供碳源和
能量，分解产生氢，为微生物提供电子供体
)1)2*
乙酸
CH 3COOH
UCV!)
为异化还原菌提供电子供体，促进）转化为
U （'）而沉淀
)3
*缓慢释放剂（SPRS ）
植物油、蔗糖、
表面活性剂
三氯乙烯（TCE ）、 四氯乙烯（PCE ）
具有较好的迁移性，为脱氯过程提供底物，创造厌 氧环境，降低自然衰减过程的延迟
)34*')35*'
)36*高锰酸钠
NaMnO 4
TCE
具有强氧化性，具有与微生物降解TCE 的协同 作用
)37*
640
表2地下水常用增氧方法
Table2Commonly methods of adding oxygen to groundwater
增氧剂类型主要成分目标污染物主要作用文献
气相空气、氧气苯、甲苯、乙苯、
二甲苯（BTEX）
为好氧微生物提供足够的氧气，促进有机
物降解，促进有机物挥发
)0*
液相H2O2苯、甲苯、氯苯H2O2经紫外处理产生羟基自由基，用于分
解有机污染物
)1]
固相CaO2、MgO2、Na2CO3
TCE、苯、
甲基叔丁基醚（MTBE）等
缓慢释放氧气，提高地下水中DO，维持好
氧环境
）2*、）3*、）4*
地下水无机氮污染范围通常较大而不适合实施工程，当前研究多处在自然衰减模拟阶段，但针对污染严重的点源可酌情利用微生物进行刺激修复#多数有机物本身可作为微生物的营养物质而被降解，最早利用微生物进行地下水污染物自然衰减的便是有机物，而当底物不足时，则需人工调节以促进有机物的快速降解#针对地下水中金属元素，其不可被微生物利用性和自然衰减速率远小于迁移速率，基本无法单独实现自然衰减修复，利用微生物进行刺激修复成为降低水体金属浓度研究的重点#
3.1无机氮污染的微生物修复
相对地下水NO］、NH g污染，世界范围内地下水NO］污染更为普遍，集约化农业种植、畜牧养殖、生产生活污水已成为地下水中NO］的主要来源）5*。分散的点状、面状污染来源往往导致地下水
NO］污染区域较大（如我国华北平原等）［8］1476，直接修复去除NO］污染的费用非常昂贵，且在大区域上修复技术不可行#自然衰减成为降低区域地下水NO］浓度的主要方式，室内模拟地下水NO］自然衰减过程，有利于识别微生物降解NO］的作用过程和机理，优化最佳NO］降解条件，评估NO］的自然衰减能力#WU等）6"5对渗透率不同的沉积物含水层中的NO］自然衰减进行研究，为识别NO］去除机制，分别对nirS、cf、dsr和微生物菌进行测定，结果表明无机化能型反硝化细菌更有利于在低渗透含水层中降解NO］#同时，WU等）6*5利用砂柱实验评估了不同渗透能力的含水层中微生物降解NO］的自然衰减能力，结果表明低渗透层更易于反硝化细菌降解NO］，这有利于了解不同渗透能力的含水层对NO］自然衰减的潜力#针对NO］污染较为严重的小范围地下水，如养殖场、集中的污灌区等，除对污染源进行控制外，必要时可采取相应的修复措施降低水体NO］浓度#PARK等曲
*针对地下
水NO］点源污染严重的养猪场附近实施单井注抽实验，以延胡索酸盐作为碳源来刺激土著微生物提高反硝化速率，加速降解地下水中NO］，通过对延胡索酸盐、示踪剂和硝态氮浓度监测和比较，确定延胡索酸盐可加速土著微生物反硝化作用的发生，且地下水中的NO］主要通过异化作用得以降解#
3.2 有机物污染的微生物修复
部分有机物本身即是微生物必需的营养物质，这为地下水有机污染的微生物修复提供可能#早在20世纪
50年代，美国科学家ZOBELL）8］发现微生物对环烃、苯系物、脂肪烃、芳香烃等有机物具有一定降解作用#此后，欧美国家开始利用多种手段监测微生物降解地下水中有机物#ANNESER 等［16］140研究显示，高度专一的降解菌不仅可自然降解地下水中的BTEX（苯系物），同时能调控低浓度有机污染晕的边界范围。从定性识别到定量评估，是地下水有机物污染自然衰减修复研究的重要历程#CHOI等）9*针对韩国某军械厂地下水BTEX
和苯污染，利用电子受体贡献率判别出不同的微生物作用降解污染物贡献率，并实现定量计算BTEX 和苯自然衰减速率及修复所需时间#而当微生物自然降解有机物所需时长不能达到修复要求时，便需要采取相应的修复措施刺激土著微生物#微生物降解污染物受限往往是因为底物不足导致,LIEN 等）0*研究发现燃油泄漏位置的地下水中石油发生微生物自然衰减同时,TCE的生物修复作用也被强化，原因是石油可作为微生物主要底物增强其代谢能力，从而加速了TCE的脱氯作用#因此，该场地可通过添加石油替代性底物以获得地下水TCE持续脱氯效果#此外，随着国内外对地下水微污染研究的关注，越来越多的学者致力于绿生态的修复方法来去除微污染，而自然衰减修复成为首要考虑的环保方法#ALDAS VARGAS等⑶
*针对农药引
起的地下水微污染，调查并提供了与地球化学参数相关的微生物菌组成和分布信息，这些信息有助于认识微生物对微污染自然衰减的过程和能力#
3.3金属污染的微生物修复
金属元素并不像有机物一样可被微生物直接利用，微生物通常通过氧化还原、甲基化去甲基化、生
641
物矿化、分泌物络合等方式降低地下水中有毒金属毒性或固定有毒金属⑺5。由于地下水中金属元素浓度相对低的多，地下水中微生物对金属污染的自然衰减能力往往较弱，而不适合利用微生物实施自然衰减修复#如何提高微生物活性来降低地下水中金属元素的毒性成为当前研究的重点#针对地下水较多出现的Cr(
*)污染，采用的原位生物修复技术通常包括生物还原法、生物吸附法和生物累计法，耐Cr微生物的大量发现使得生物还原法成为当前研究的重点#陈国才E利用专门驯化的实验菌进行地下水Cr污染去除模拟，通过零价铁和微生物协同作用达到去除目的，一方面零价铁的强还原性能有效将Cr(
*)还原为Cr(&)，同时零价铁厌氧环境与比0反应产生的H z可刺激嗜氢微生物，进一步还原Cr(
*)。FAYBISHENKO等皿在美国华盛顿汉福德基地进行了为期约3.5年的Cr污染地下水生物刺激修复工程，通过添加释氢化合物(HRC)提高生物通量来影响电子受供体，最终显著降低了地下水中溶解态的Cr(*)此后,ZHANG等针对该污染场地，鉴定了在HRC刺激下与Cr(
*)还原相关的功能微生物和基因，这为设计Cr(*)污染地下水的持续性生物刺激修复方案提供依据#
4展望
微生物修复是一种基于微生物自身代谢功能降解污染物的技术，通过利用和刺激土著微生物菌，实现其对地下水中多种污染物的降解作用，达到地下水污染修复目的#针对地下水中无机氮、有机物和金属元素3大类污染修复，往往需要考虑污染物种类、污染地下水体分布情况、污染程度、修复要求等因素，综合判定微生物修复是否适用#同时，应用现代分子生物学技术，从微生物落多样性、组成、功能基因、转录表达等方面揭示功能微生物菌降解污染物过程，为制定地下水污染长期的微生物修复方案提供依据#
微生物在地下水污染修复应用研究中仍存在一些急需解决的关键问题：(1)充足的底物供应是微生物降解的必要条件，如何保证在地下水弱电导环境中功能菌具有足够的底物和电子供体；(2)如何尽可能保证修复后地下水中不产生新的污染物，特别是添加剂、微生物通量和降解过程产生的二次产物；
(3)目前我国多数研究处于室内模拟，如何将微生物修复技术从实验阶段大量转化为实地修复，仍会面临诸多问题；(4)由于地下水环境的复杂性，分子生642物学技术在地下水污染修复中应用并不多，这对揭示微生物落结构与功能对污染响应关系和污染物降解机理不利，未来应加强对此领域的深入研究#
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