食品安全国家标准
11 范围
本标准适用于食品中维生素B1含量的测定。
第一法 高效液相谱法
12 原理
13 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 正丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。
3.1.2 铁(K3Fe(CN)6)。
3.1.3 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.4 盐酸(HCl)。
3.1.5 乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。
3.1.6 冰乙酸(CH3COOH)。
3.1.7 甲醇(CH3OH)：谱纯。
3.1.8 五氧化二磷（P2O5）或者氯化钙（CaCl2）。
3.1.9 木瓜蛋白酶：应不含维生素B1，活力单位≥800 U/mg。
3.1.10 淀粉酶：应不含维生素B1，活力单位≥3700 U/mg。
13.2 试剂配制
3.2.1 铁溶液（20 g/L）：称取2 g 铁，用水溶解并定容至100 mL，摇匀。临用前配制。
3.2.2 氢氧化钠溶液（100 g/L）：称取25 g 氢氧化钠，用水溶解并定容至 250 mL，摇匀。
3.2.3 碱性铁溶液：将5 mL 铁溶液与200 mL 氢氧化钠溶液混合，摇匀。临用前配制。
3.2.4 盐酸溶液（0.1 mol/L）：移取8.5 mL 盐酸，加水稀释至1000 mL，摇匀。
3.2.5 盐酸溶液（0.01 mol/L）：移取0.1 mol/L 盐酸溶液50 mL，用水稀释并定容至500 mL，摇匀。
3.2.6 乙酸钠溶液（0.05 mol/L）：称取6.80 g 乙酸钠，加900 mL 水溶解，用冰乙酸调pH 值为4.0～5.0之间，定容至 1000 mL。经0.45 μm 微孔滤膜过滤后使用。
3.2.7 乙酸钠溶液（2.0 mol/L）：称取 27.2 g 乙酸钠，用水溶解并定容至100 mL，摇匀。
3.2.8 混合酶溶液：称取 2.0 mg 木瓜蛋白酶（活力单位≥800 U/mg）、3.0 mg 淀粉酶（活力单位≥3700 U/mg），加水定容至50 mL，涡旋，使呈混悬状液体，冷藏保存。临用前再次摇匀后使用。
3.3 标准品
维生素B1标准品：盐酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl))，CAS: 67-03-8，纯度≥99.0 %。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 维生素B1标准储备液（500 μg/mL）：准确称取相当于50 mg（精确至0.1 mg）硫胺素、经五氧化二磷或者氯化钙干燥24小时的盐酸硫胺素标准品，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定容至100 mL，摇匀。置于0 ℃～江涛个人资料4 ℃冰箱中，保存期为3个月。
3.4.2 维生素B1标准中间液 (10.0 μg/mL)：准确移取2.00 mL 标准储备液，用水稀释并定容至100 mL，摇匀。临用前配制。
3.4.3 维生素B1标准系列工作液：吸取维生素B1救亡图存的意思标准中间液0 μL、20.0 μL、100 μL、200 μL、400 μL，800 μL中秋节的朋友圈说说心情，1000 μL，用水定容至10 mL，标准系列工作液中维生素B1的浓度分别为0 μg/mL，0.0200 μg/mL，0.100 μg/mL，0.200 μg/mL，0.400μg/mL，0.800 μg/mL，1.0 0μg/mL。临用时配制。
14 仪器和设备
4.1 高效液相谱仪，配置荧光检测器。
4.2 分析天平：感量为0.01g 和0.1 mg。
4.3 离心机：转速≥4000 r/min。
4.4 pH 计：精度0.01。
4.5 组织捣碎机（最大转速不低于12000 r/min）。
4.6 电热恒温干燥箱或高压灭菌锅。
5 分析步骤
5.1 试样的制备
5.1.1 液体或固体粉末样品：将样品混合均匀后，立即测定或于冰箱中冷藏。
5.1.2 新鲜水果、蔬菜和肉类：取100 g左右样品，用匀浆机或者粉碎机将样品均质后，制得均匀性一致的匀浆，立即测定或者于冰箱中冷冻保存。
5.1.3 其他含水量较低的固体样品：适用含水量在15%终极关怀左右的粮食谷物；取100 g左右样品，用粉碎机将样品粉碎后后，制得均匀性一致的粉末，立即测定或者于冰箱中冷藏保存。
5.2 试样溶液的制备
5.2.1 试液提取
称取3 g~5g（精确至0.01 g）固体试样或者10 g ~20 g液体试样于100 mL三角瓶中(带有软质塞子)，加30 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，放入电热恒温干燥箱中于120 ℃保持30 min，或者在高压灭菌锅中121 ℃保持30 min。水解结束待冷却至40 ℃以
下取出，轻摇数次；用pH计指示，用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH 值至4.0 左右，加入1.0 mL（可根据酶活力不同适当调整用量）混合酶溶液，摇匀后，置于培养箱中37 ℃过夜（约16 h）；将酶解液全部转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，离心或者过滤，取上清液备用。
5.2.2 试液衍生化
准确移取上述上清液或者滤液 2.0 mL 于10 mL试管中，加入1.0 mL 碱性铁溶液，涡旋混匀后，准确加入2.0 mL 正丁醇，再次涡旋混匀1.5 min后静置约10 min或者离心，待充分分层后，吸取正丁醇相（上层）经0.45 μm有机微孔滤膜过滤，取滤液于2 mL棕进样瓶中，供分析用。若试液中维生素B1浓度超出线性范围的最高浓度值，应取上清液稀释适宜倍数后，重新衍生后进样。
另取2.0 mL 标准系列工作液，与试液同步进行衍生化。
注1：室温条件下衍生产物在4 h 内稳定。
注2: 5.2.1和5.2.2vienna teng操作过程应在避免强光照射的环境下进行。
注3：辣椒干等样品，提取液直接衍生后测定时，维生素B1的回收率偏低。提取液经人造沸石净化后，再衍生时维生素B1的回收率满足要求。故对于个别特殊样品，当回收率偏低时，可尝试净化后再衍生的方法，具体操作步骤见第二法12.1.3部分。
5.3 仪器参考条件
5.3.1 谱柱：C18反相谱柱（粒径 5 μm，250 mm ×4.6 mm）或相当者。
5.3.2 流动相：0.05 mol/L 乙酸钠溶液－甲醇（65＋35）。
5.3.3 流速：0.8 mL/min。
5.3.4 检测波长：激发波长 375 nm，发射波长 435 nm。
5.3.5 进样量：20 μL。
5.4 标准曲线的制作
将标准系列工作液衍生物注入高效液相谱仪中，测定相应的维生素B1峰面积，以标准工作液的浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见附录快快乐乐造句A。
5.5 试样溶液的测定
按照上述推荐谱条件，将试样衍生物溶液注入高效液相谱仪中，得到维生素B1的峰面积，根据标准曲线计算得到待测液中维生素B1的浓度。
6 分析结果的表述
试样中维生素B1含量按公式（1）计算：
……………………………………（1）
式中：
X ——试样中维生素B1的含量（以硫胺素计），单位为毫克每百克（mg/100 g）；
c ——由标准曲线计算得到的试液（提取液）中维生素B1的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——试液（提取液）的定容体积，单位为毫升（mL）；
f——试液（上清液）衍生前的稀释倍数；
m ——试样的质量，单位为克（g）。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
注：由硫胺素含量转变为盐酸硫胺素含量时的折算系数为1.121。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。
8 其他
当称样量为3.0 g时，按照本标准的定容体积，食品中维生素B1的检出限为0.03 mg/100g，定量限为0.09 mg/100g。
第二法 荧光分光光度法
9 原理
硫胺素在碱性铁溶液中被氧化成噻嘧素，在紫外线照射下，噻嘧素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液用于测定。
10 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的二级水。
10.1 试剂
10.1.1 正丁醇（CH3CH2CH2CH2OH）。
10.1.2 无水硫酸钠（Na2SO4）：560 ℃烘烤6 h后使用。
10.1.3 铁(K3Fe(CN)6)。
10.1.4 氢氧化钠(NaOH)。
10.1.5 盐酸(HCl)。
10.1.6 乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。
10.1.7 冰乙酸(CH3COOH)。
10.1.8 人造沸石。
10.1.9 硝酸银（AgNO3）。
10.1.10 溴甲酚绿（C21H14Br4O5S）。
10.1.11 五氧化二磷（P2O5）或者氯化钙（CaCl2）。
10.1.12 氯化钾（KCl）。
10.1.13 淀粉酶：不含维生素 B1，活力单位≥3700 U/mg。
10.1.14 木瓜蛋白酶：不含维生素 B1，活力单位≥800 U/mg。
10.2 试剂配制
10.2.1 0.1 mol/L盐酸溶液：移取8.5 mL盐酸，用水稀释并定容至1000 mL，摇匀。
10.2.2 0.01 mol/L盐酸溶液：移取0.1 mol/L 盐酸溶液50 mL，用水稀释并定容至500 mL,摇匀。
10.2.3 2 mol/L乙酸钠溶液：称取272 g乙酸钠，用水溶解并定容至1000 mL，摇匀。
10.2.4 混合酶液：称取 2.0 mg 木瓜蛋白酶（活力单位≥800 U/mg）、3.0 mg 淀粉酶（活力单位≥3700 U/mg），加水定容至50 mL，涡旋，使呈混悬状液体，冷藏保存。临用前再次摇匀后使用。
10.2.5 氯化钾溶液（250 g/L）：称取250 g氯化钾，用水溶解并定容至1000 mL，摇匀。
10.2.6 酸性氯化钾（250 g/L）：移取8.5 mL盐酸，用250 g/L 氯化钾溶液稀释并定容至1000 mL，摇匀。
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