Notch信号通路与心脏发育和组织再生
陈浩;徐志伟
【摘 要】Notch信号通路参与细胞增生、分化和凋亡等诸多过程.Notch不仅在心血管系统发育中发挥重要作用,而且通过阻止心肌细胞过度肥大和维持干细胞池功能稳定,参与成体心脏的内稳态调节和心肌修复过程.文章就近年来有关Notch信号通路结构特点、调控胚胎期和出生后心脏发育、维持心脏结构完整性及应用于组织再生等方面的研究进展作一综述.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(030)004
【总页数】4页(P463-466)
【关键词】Notch;心脏发育;再生;调控
【作 者】陈浩;徐志伟
【作者单位】上海交通大学医学院上海儿童医学中心心胸外科,上海200127;上海交通大学医学院上海儿童医学中心心胸外科,上海200127
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.1
1917年，研究发现果蝇部分功能缺失可导致翅缘缺损,并将此突变系命名为“Notch”，约70年后,人们首次从果蝇体内克隆出Notch基因,并逐步揭示出其基本结构。Notch信号由相邻细胞膜外配体与受体结合所启动，激发下游通路一系列级联反应，并与其他信号通路共同构成复杂而庞大的网络结构。随着基因学研究技术的进步，Notch信号的内部组成、关联外部信号以及二者协同诱导独特细胞表型的机制正逐步得以阐明。
1 经典Notch信号通路
Notch受体和配体均是单次跨膜蛋白，由胞外区和胞内区2个功能区组成。哺乳动物有4种Notch受体(Notch1～4)，5种配体(delta-like1,3,4和jagged1,2)则分属2类家族(Delta和Serrate/Jagged)。在胞质中的转运高尔基体内，Notch受体首先被弗林转化酶割裂为2个蛋白
水解片段(S1)，由非共价键连接并转运至细胞膜组成异二聚体。在此，Notch受体与同源配体结合，导致外功能区脱落，暴露出跨膜蛋白酶ADAM/TACE家族的水解位点而经历第2次酶切(S2)。在γ-促分泌酶介导下，剩余的Notch片段接受另外一次胞内酶切过程(S3)，释放出的胞内区(NotchICD)转移至核内与CSL(人类为CBF-1，大鼠为RBP-J)结合，将后者由转录抑制物转化为激活物。Notch信号激活前，CSL募集SMRT、SHARP、CtBP等共抑制物，并联合组蛋白脱乙酰基酶抑制靶基因活性；而当NotchICD被释放出并与CSL、MAM组成共激活物时，后者随即募集组蛋白乙酰基转移酶p300，启动转录过程。转录复合物的靶基因主要是编码碱性螺旋-环-螺旋类蛋白(basic helix-loop-helix,bHLH)的Hes和Hey家族。Notch转录活性的维持时间部分由MAM控制，后者激活后不久募集核激酶CDK8，在Fbw7的参与下降解NotchICD。
2 Notch信号通路在心脏发育中的作用
2.1 Notch组件的表达 Notch在哺乳动物线性心管形成前后的表达特性已被清晰揭示。鼠胚胎第7.5天时，Notch1首先表达于原条阶段中胚层；第8天后局限于原始心管流出道内膜层；Notch4和delta-like 4(Dll4)亦于心内膜中表达，而Notch2直到第13.5天才出现在心房和心室
肌中；Notch3在早期头褶阶段表达于生心板中而于第8天消失。第9.5天时，delta-like 1(Dll1)出现于心室小梁肌底部心内膜区；而从第12.5天开始，Jagged1在心室流出道房室区、心房肌和心室小梁肌部均有表达[1]。Hey基因的表达模式与Notch大体相仿。Hey1表达首先在新月形生心区中检出，第10.5天后局限于心房肌中；Hey2在心管阶段表达于心室区，当心腔形成后局限于致密层心肌中[2]。Hey1和Hey2的表达水平在出生后逐渐减退。
2.2 Notch信号与房室管发育 Notch1过度表达及Jagged1、Hey2、Hey1/2和CSL缺乏均可造成房室管发育异常。Hes1和Hes2过度表达抑制转录因子Bmp2和Tbx2，导致房室管界线消失；而在敲除Hes1、Hes2的大鼠以及gridlock(Hey2同源物)突变的斑马鱼胚胎中，Bmp2和Tbx2基因的表达范围明显扩大；证实Notch信号通路通过调控Bmp2和Tbx2基因表达影响房室管的界限形成[3]。
房室管形成后，在邻近心肌诱导信号刺激下心内膜细胞发生形态学改变(内皮细胞向间叶细胞转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)，侵入下方心胶质中形成心内膜垫，并进一步重塑形成瓣膜组织。在此阶段，Notch1,2,4、Jagged1和Dll4以及下游靶基因Hey1,2和HeyL均在房室管的心内膜处表达。Hey1/2双突变和Notch1缺失均会导致EMT不足[2]；Hey1
和HeyL联合缺失造成EMT严重低下并导致膜部室间隔缺损和瓣膜发育不良等多种心脏畸形[4]。Timmerman等[2]发现，注入斑马鱼体内的活化NotchICD基因能够增强心内膜细胞有丝分裂并产生异常肥大的瓣膜组织；而Notch1单倍剂量不足则导致二叶畸形和钙化等主动脉瓣膜异常。EMT还与转录因子Snail家族密切相关，后者能够下调VE钙黏蛋白的表达。Notch1突变造成Snail和Slug基因表达下降，减弱了对VE钙黏蛋白的抑制作用而导致心内膜垫细胞数量明显下降；相反，重新表达Notch1基因能够部分抵消这种缺陷[1]。
2.3 Notch信号与心室发育 心室发育过程中心肌前体细胞分化为外部致密层和内部小梁层，后者进一步重塑形成传导组织和室间隔。Notch1和Dll1,4于小梁层底部心内膜表达，敲除Notch1大鼠胚胎小梁肌形成缺陷且失去特征标志物表达能力；而Notch1过度表达则导致房室管区出现异位表达的小梁肌。小梁肌的形成需要EphB2及其受体EphB4、神经调节蛋白NRG1及其受体ErbB2,4和BMP10的共同参与。NRG1、ErbB2或ErbB4缺陷均可能导致胚胎死亡和严重的肌小梁发育障碍；而外源性BMP10或NRG1能够补救敲除Notch1的心室发育缺陷，证明心内膜Notch信号作为上述基因的上游调节因子在肌小梁发育过程中具有重要作用。Grego-Bessa等[5]据此提出了2条相互平行的调节途径。第一条途径中，心内膜细胞Dll1,4配体激活Notch信号诱导EphB2/4二聚体形成，后者进一步增强NRG1表达，从而促使
邻近前体细胞向肌小梁分化；另一条途径中，心内膜Notch信号通过激活邻近前体细胞中的BMP10表达而促进心肌分化。
Hey2对于心室发育同样关键。Hey2缺陷鼠出现心肌收缩功能受损、右心室畸形和室间隔缺损，并且左心室中检出较多心房组织标志物(ANF、Tbx5、 Mlc1a/2a)；而当Hey2过度表达时，心房标志物表达水平明显下降[6]。Fischer等[7]认为，Hey2通过抑制心室致密层中广泛存在的GATA4和GATA6活性，防止心房标志物错误表达，从而维持致密层心肌的正常发育。
传导组织与成熟心肌来源于相同的心肌前体细胞。有证据表明，Notch信号通路与心脏转导组织发育关系密切。Milan等[8]发现，Notch1在斑马鱼房室环心内膜中有明显表达，敲除Notch1能够阻断房室环中央传导组织形成。另一项研究[9]则提示，Notch表达增强能够上调鸟类传导组织标志物HNK-1和SNAP-25表达，而转导因子Su(H)突变则造成相反的结果。
2.4 Notch信号与流出道发育 流出道发育时，Notch2,3、Jagger1、Hey1,2和HeyL由来源于神经嵴的血管平滑肌细胞表达。神经嵴含有多种背侧神经管来源的前体细胞，在分化前阻断Notch信号可引起明显的血管平滑肌细胞数量下降，产生肺动脉狭窄和主动脉弓缺陷等类似于Alagille综合征的表型特征；后者是一类涉及心、肝、肾、眼和脊柱的常染体显性遗传病，
buchi
与Jagger1或Notch2,3突变密切相关[10]。
3 Notch信号通路与细胞命运
3.1 Notch与细胞定型 在胚胎发育和成体阶段，Notch配体和邻近细胞对应受体的相互作用激活信号级联反应，相同的前体细胞发生了不同的命运转变。内吞Notch配体并再循环返回细胞膜能够激活配体本身并产生足够的牵拉力，离解异二聚体受体从而促进蛋白裂解；这一过程部分由E3泛素连接酶Neur1,2和Mib1,2调节。Mib1缺乏大鼠完全失去Notch活性[11]，而Mib1突变的斑马鱼则发生明显的神经表型改变和包括心脏、体节、神经嵴、脉管系统等在内的大范围组织缺陷[12]。膜相关蛋白Numb通过对抗Notch活性决定了细胞命运，这一过程同样与细胞内吞和膜转运关系密切。Numb蛋白在子代细胞中的分配方式直接决定了神经元细胞的产生数量：非对称分配仅生成1个神经元细胞而平均分配产生2个相同的神经元细胞[13]。
Hes和Hey在Notch信号通路中扮演了调节中枢的角。研究[14]发现，神经前体细胞中Hes1存在周期为2～3 h的循环振荡表达，在其控制下的Notch配体Dll1和原神经基因Ngn2也存在类似表达；而无Hes1表达的有丝分裂完成后的神经元细胞，Dll1和Ngn2则持续存在。Hes1
所驱动的Ngn2和Dll1振荡似乎通过相互激活Notch信号而有利于细胞未分化状态的维持。进一步研究[15]表明，Numb阳性细胞中的Hes1表达被持续抑制从而导致前体细胞向神经元方向分化；而Numb阴性细胞中的Hes1持续表达使未分化状态得以维持。
3.2 Notch与心肌细胞分化 Notch对人类胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)增生和更新起重要作用。通过激活AKT/PI3K信号通路，Notch增加了人类ESC的集落生成率。虽然缺乏Notch活性的ESC仍能产生主要的三胚层原基并且至少发育至原肠胚阶段，说明Notch对于心区结构特异性分化和心脏中胚层诱导并非完全必要[16]。但ESC定型被心脏细胞分化过程中Notch1,4的表达所关闭，则说明其对于后续心脏组织分化具有抑制作用：激活Notch信号降低了非洲爪蟾和果蝇胚胎新月区细胞的心肌基因表达，而缺乏Notch活性的ESC表现出明显增强的中胚层和心肌组织分化[17-18]。进一步研究[19]发现，在Notch失活的ESC中，Brachyury和Flk1基因表达上升；而在Notch过度表达的ESC中，二者表达明显受抑。通过操控这条信号通路，一些研究已经成功地从Flk1+成血管细胞中大量诱导分化出心肌细胞。Boni等[20]发现，成体心脏干细胞池中约60%心脏前体细胞表达Notch1，而周围支持细胞则表达Jagged1；启动心脏前体细胞Notch1活性能够增强Nkx2.5表达，促使前体细胞向心肌细胞分化和抑制其向血管平滑肌细胞分化，从而起到关键的“基因开关”作用。
4 Notch与心脏再生
越来越多的证据显示，Notch参与了成体心脏内稳态平衡的调节。研究[21]发现，心脏受损后不久Notch表达增强；而注入表达NotchICD腺病毒载体的梗死心脏血流动力学改善明显，说明这种胚胎期基因的重新表达是继发于成体心肌病理损伤的一种适应性反应，并且与存活心肌修复再生受损组织密切相关。斑马鱼心脏惊人的再生能力证明，Notch在维持心脏组织干细胞池方面起到了重要作用；同样，未分化的Numb阳性细胞被发现存在于成年大鼠心脏类似干细胞池的间隙结构中，这些细胞在修复心肌组织时可能经历与骨骼肌再生过程相类似的非对称细胞分裂[22]。此外，老年机体由于Notch表达降低引起干细胞活性降低和再生功能受损，但当外源性Notch引入后又可恢复[23]。Sainson等[24]研究发现，低氧诱导产生的HIF1能够激活Notch信号，从而有利于干细胞池中未分化细胞的增生。