（HPLC ELSD），选用正相硅整体胶柱，正己烷异丙醇乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，该方法操作简单、准确度高，可以对南极磷虾油中磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）三种主要磷脂的进行准确定性和定量分析。
权利要求书
1.一种南极磷虾油中磷脂的检测方法，其特征在于它包括以下步骤:
（1）样品溶解：准确称取50mg磷虾油，加入3ml谱纯氯仿，涡旋混合。
（2）样品净化：取氨基固相萃取柱（1000 mg/6 ml）先用5ml氯仿活化，然后将溶解后的
磷虾油试样移入固相萃取柱中上样，依次用15ml的氯仿-异丙醇溶液（2:1），10ml乙醚-乙酸溶液（72:1），15ml甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液，洗脱液用旋转蒸发在35℃条件下浓缩近干，然后加入正己烷-异丙醇（2:3）溶解定容至10 mL，10000 r/min 离心5分钟后过0.45
μm有机滤膜用于谱分析。
（3）液相谱-蒸发光检测器测定：在优化的谱条件下，将三种磷脂的混合标准溶液和样品待测液进样依次测定，根据标准品的保留时间确定样品中的磷脂组分，以标准溶液中各组分谱峰面积为横坐标，各组分的质量浓度为纵坐标进行回归分析，将样品溶液的峰面积代入乘幂回归方程，从而获得样品中目标物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）取氨基固相萃取柱用氯仿活化上样后，依次用15ml的氯仿-异丙醇溶液（2:1），10ml乙醚-乙酸溶液（72:1），15ml甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中对洗脱液进行浓缩时旋转蒸发温
度为35℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中优化的谱条件为：Chromolith Performance-Si正相整体硅胶谱柱4.6 mm×100mm；柱温：25℃；流速：1.5mL/min；载气压力：40 psi；漂移管温度：55 ℃；进样量：10 µL；流动相：A为正己烷（含0.04%三乙胺），B为异丙醇C 为13%乙酸水溶液；洗脱梯度：0~0.5min，40% A, 57%B, 3%C；
0.5~8.0min，40% A, 50%B, 10%C；8.0~12.0 min，40% A, 50%B, 10%C。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中各标准品的浓度范围分别为：PE（10~180 μg/mL）、PC（30~540 μg/mL）及LPC（20~360 μg/mL）。以磷脂浓度为横坐标，谱峰峰面积为纵坐标，按y=axb对标准曲线进行拟合，分别得到3种磷脂的乘幂曲线方程。
技术说明书
一种南极磷虾油中磷脂的检测方法
技术领域
本技术属于水产品检测技术领域，具体涉及一种南极磷虾油中磷脂的定性及定量检测方法。背景技术
磷虾油是以优质磷虾粉为原料，经干燥、提取、过滤、分离、纯化、浓缩精制得到的产品。磷虾油富含磷脂、DHA、EPA等ω-3必需脂肪酸，且ω-3脂肪酸以磷脂形式存在，生物体利用率高达95％～98％，具有优异的健脑、抗炎症、增强免疫力等功能，对心血管、神经、骨骼和关节、视力、皮肤等有健康益处，2013年底，磷虾油被获批为国家新食品原料(国家卫生
计生委2013年第16号文)，可作为普通食品原料，为南极磷虾的综合开发利用创造了有利条件。
磷脂为含有磷酸的脂类，根据结构可分为甘油磷脂和鞘磷脂。甘油磷脂与甘油三酯类似，其差异在于磷
酸基取代了其中一种脂肪酸，甘油磷脂中含量较高有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇，具有防治心血管疾病，改善学习能力，增强免疫力等功能特性。鱼类和甲壳类等海产动物是动物磷脂的主要来源，特别是从南极磷虾萃取的磷虾油中磷脂含量丰富，约为40％～45％。磷脂种类丰富，而国内常用的检测方法如比法、分光光度法、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法，只能测定其中总磷脂的含量，而且影响因素多，成分的准确性较差，无法对其关键成分进行定量分析检测，另外现有的食品国标中的磷脂液相谱检测方法检测范围不包括水产品及其制品，导致不能准确全面反映产品的质量优劣。由于目前我国缺少对水产品中磷脂的测定方法标准，无法开展对水产品包含南极磷虾油等产品的营养评价，也阻碍了水产品高值化利用的步伐，因此急需建立水产品及其制品中磷脂含量的测定。已有研究证明HPLC是目前磷脂分离和定性定量分析中最常用的方法，紫外检测器(UV)和蒸发光散射检测器(ELSD)是常用检测器。由于ELSD的响应信号独立于分子中的不饱和双键数目，不仅比UV检测器更为灵敏而且ELSD在梯度洗脱程序中能提供稳定的基线，因此，适宜建立HPLC-ELSD法检测南极磷虾油中磷脂。
技术内容
本技术解决的技术问题是提供一种南极磷虾油中磷脂的定性及定量检测方法。本技术以加工过的磷虾油原油或胶囊为研究对象，加入氯仿溶解稀释后，再用Sep-pak NH2固相萃取小柱去除脂质等干扰物，实现了多种磷脂的同步提取净化；同时，在优化谱条件的基础上，利用HPLC-ELSD不仅改善了磷脂的
分离效果，实现了同时分析磷虾油中三种主要磷脂即磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)，并获得了高灵敏的定量结果。本技术方法提高了磷虾油中磷脂测定方法的准确性和可靠性，为准确评价磷虾油中磷脂含量提供了新技术手段。
本技术是通过以下技术方案实现的:
一种南极磷虾油中磷脂的测定方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)样品溶解：准确称取50mg磷虾油样品，于10mL玻璃管中，加入3mL氯仿混匀溶解样品。
(2)样品净化：取上述溶解的样品直接加载到预先用5ml氯仿活化的Sep-pak NH2固相萃取柱中，依次用15.0mL氯仿-异丙醇(2:1)溶液和10.0mL乙醚-乙酸混合溶液(72:1)淋洗小柱，再用15.0mL甲醇洗脱；洗脱液用旋转蒸发在35℃条件下浓缩近干，加入正己烷-异丙醇(2:3)混合溶液溶解定容至10mL，过0.45um滤膜然后上机检测分析；
(3)液相谱-蒸发光散射法测定：在优化的谱条件下，将三种磷脂的的混合标准溶液和样品待测液分别进样测定，以标准溶液中各组分的的保留时间对样品中的磷脂种类进行定性分析，以标准溶液中各组分的质量浓度为横坐标，各组分的峰面积为纵坐标制作标准曲线，将样品溶液的峰面积代入乘幂方程，采用外标法分析样品中磷脂的含量；
进一步，所述步骤(1)中氯仿为谱纯。
进一步，所述步骤(2)中所用试剂均为谱纯，固相小柱为氨基柱，洗脱试剂依次为15.0mL 氯仿-异丙醇(2:1)，10.0mL乙醚-乙酸混合溶液(72:1)，15.0mL甲醇，收集甲醇相浓缩时旋转蒸发的温度为35℃。
进一步，所述步骤(3)中优化的谱条件为：Chromolith Performance-Si整体硅胶谱柱
4.6×100mm；柱温：25℃；流速：1.5mL/min；载气压力：40psi；漂移管温度：55℃；进样量：10μL；流动相：A为正己烷(含0.04％三乙胺)，B为异丙醇，C为13％乙酸水溶液；洗脱梯度：0～0.5min，40％A,57％B,3％C；0.5～8.0min，40％A,50％B,10％C；8.0～
12.0min，40％A,50％B,10％C。
进一步，所述步骤(3)中标准曲线为：各标准品的浓度范围分别为：PE(10～180μg/mL)、
PC(30～540μg/mL)及LPC(20～360μg/mL)。以磷脂浓度为横坐标，谱峰峰面积为纵坐标，按y＝axb对标准曲线进行拟合，分别得到3种磷脂的标准曲线方程。
本技术与现有技术相比的有益效果：
1.用蒸发光测磷虾油中磷脂没有文献报道过，相对于报道的其他方法，本方法更除了能定量不同磷脂且结果准确些。本技术技术方案利用蒸发光散射检测器对磷虾油中的磷脂进行检测，相对于紫外检测器检测结果偏高和钼蓝比法不能对磷脂种类进行分析，能更准确的对磷脂种类和含量进行分析。
2.Sep-pak NH2固相萃取柱净化策略，相对于预填装的简易硅胶柱，不仅实现对PC/PE/LPC的有效富集保留，还能除去磷虾油中其它的脂质干扰，保证实验的稳定性；本方法采用氨基柱进行了净化，降低基质对结果干扰，基线更稳定。
3.本技术技术方案选用硅胶整体柱，其高流速，高柱效的优点将流速提高为1.5mL/min分析时间缩短为12分钟；使用正己烷(含0.04％三乙胺)，异丙醇，13％乙酸水溶液作为流动相，洗脱梯度实现了各组分的基线分离。本方法的取样量和标准曲线的范围经过优化后更适合磷虾油磷脂的含量测定。
附图说明
图1为三种磷脂标准品混合液HPLC-ELSD谱图。
图2为南极磷虾油实际样品中磷脂的HPLC-ELSD谱图。
图3为3种磷脂的乘幂方程曲线。
具体实施方式
buchi下面通过实施例对本技术的技术方案做进一步解释，但本技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例
1、本实施例选用的仪器和试材
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