第42 卷第 9 期2023 年9 月
Vol.42 No.9
1134~1140分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）
王军1，3，4，邱荣英1，3，4，成祥旭1，3，4，李涛1，3，4，刘金明1，3，4，田洪武1，3，4，
李铁健1，3，4*，张贵民2，3，4*
（1．山东新时代药业有限公司，山东临沂273400；2．鲁南制药集团股份有限公司，山东临沂276005；3．国家手性制药工程技术研究中心，山东临沂276005；4．山东省手性制药技术创新中心，山东临沂276005）
摘要：采用生长抑素与硫代硫酸钠（Na2S2O3）反应生成生长抑素三硫化物，并使用高压制备液相谱法将其纯化后冻干，利用高分辨质谱对其精确分子量、肽序列与三硫键连接位点进行检测。结果表明，当生
长抑素与Na2S2O3摩尔比为1∶2时，60 ℃水浴下反应1 h，即可生成生长抑素三硫化物，对其纯化、脱盐、冻干后，最终获得纯度大于95%的目标物。通过质谱分析，其加合离子［M+2H］2+的m/z为835.353 9、［M+3H］3+的m/z 为557.236 9，肽序列为A-G-C-K-N-F-F-W-K-T-F-T-S-C，三硫键连接位点为Cys（3）-Cys（14），均与理论结构一致。该研究可为生长抑素的质量研究提供依据。
关键词：生长抑素三硫化物；高压制备液相谱；纯化；质谱分析；质量研究
中图分类号：O657.7；R917文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）09-1134-07
The Preparation and Mass Spectrometry Analysis of
Somatostatin Trisulfide
WANG Jun1，3，4，QIU Rong-ying1，3，4，CHENG Xiang-xu1，3，4，LI Tao1，3，4，LIU Jin-ming1，3，4，
TIAN Hong-wu1，3，4，LI Tie-jian1，3，4*，ZHANG Gui-min2，3，4*
（1．Shandong New Times Pharmaceutical Co.，Ltd.，Linyi 273400，China；2．Lunan Pharmaceutical Group
Co.，Ltd.，Linyi 276005，China；3．National Engineering and Technology Research Center of Chirality
Pharmaceutical，Linyi 276005，China；4．Shandong Technology Innovation Center of Chiral Pharmaceutical，
Linyi 276005，China）
Abstract：In this study，somatostatin trisulfide was generated by the reaction of somatostatin with so⁃dium thiosulfate（Na2S2O3），and then freeze-dried after purified by high pressure preparation liquid chromatography. The exact mass，peptide sequence and trisulfide bond assignment were detected by high resolution mass spectrum. The results showed that somatostatin trisulfide was generated by reac⁃tion of somatostatin with Na2S2O3 when the molar ratio was 1∶2，and reacted in a 60 ℃ water bath for 1 h. The purity of somatostatin trisulfide was greater than 95% after purified，desalinated and freeze-dried. It was analyzed by mass spectrometry. The m/z of［M+2H］2+ was 835.353 9 and［M+3H］3+ was 557.236 9，the peptide sequence was A-G-C-K-N-F-F-W-K-T-F-T-S-C，and the trisulfide bond was Cys（3）-Cys（14），which were consistent with theoretical structure of somatostatin trisul⁃fide. The research provided a basis for quality research of somatostatin.
Key words：somatostatin trisulfide；high pressure preparation liquid chromatography；purifica⁃tion；mass spectrometry analysis；quality research
生长抑素（结构如图1A）是由下丘脑分泌的一种肽类激素，是由9种氨基酸组成的环状肽，主要作用于消化道、胰腺、中枢与外周神经系统，临床上用于上消化道出血、急性胰腺炎、肝硬化合并出血等疾病［1-5］。最新研究表明，该药物对肿瘤也有一定效果［6］。
目前大多数多肽药物通过固相合成技术获得，但在合成与存储过程中易形成杂质，包括氨基酸插入、氨基酸丢失、氧化/还原反应、多聚体杂质等，有些杂质不但没有疗效，反而具有毒副作用［7］。2023年2月国家食品药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布了《化学合成多肽药物药学研究技术指导
收稿日期：2023－05－20；修回日期：2023－07－03
基金项目：山东省重大创新工程项目（2019JZZY010516）
∗通讯作者：李铁健，工程师，研究方向：药物分析、制备与结构确证，E-mail：158****5005@163
张贵民，高级工程师，研究方向：中药、化药与生物制品的新药研发，E-mail：Lunanzhangguimin@163
doi：10.19969/j.fxcsxb.23052001
第 9 期王军等：生长抑素三硫化物的制备与质谱分析
原则（试行）》（简称《原则》），为多肽类药物的质量研究提供了依据。该《原则》指出在外界因素下，肽类药物中的半胱氨酸（Cys ）可能发生β-消除反应产生降解杂质，需进行深入研究［8］。有研究表明含有二硫键的蛋白类药物发生β-消除反应后，会进一步产生三硫化物杂质［9-10］。目前，生长抑素工艺杂质、异构体杂质与二聚体杂质均有
报道［1，11-14］，而生长抑素三硫化物（理论结构如图
1B ）杂质国内外均未见报道。本研究首次对生长抑素三硫化物进行制备纯化并获得纯品，对其进行质谱分析，并确认了精确分子量、肽序列与三硫键连接位点，为生长抑素的质量研究提供了依据，对其他多肽类药物的三硫化物杂质研究也具有重要意义。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
生长抑素（批号：504200601，鲁南新时代生物技术有限公司）；磷酸、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、乙酸、硫代硫酸钠与三乙胺均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；甲酸为质谱纯，购自TCI 公司；三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP ·HCl ）为分析纯，购自Thermo 公司；乙腈为谱纯，购自Merck 公司；制备级乙腈，购自潍坊中汇化工有限公司；超纯水为实验室自制。
1.2 仪器与设备
Waters Acquity H-Class 型超高效液相谱系
统（Waters 公司）；Synapt-XS 高分辨质谱仪（Waters 公司，配Masslynx V4.2与Unifi Portal 软件）；Agilent 1260 HPLC 液相谱系统（美国Agilent 公司）；NP7000-DAC50mm 动态轴向压缩制备液相谱系统（江苏汉邦科技有限公司）；FD8-3a 真空冷冻干燥机（GOLD-SIM 公司）；R-220 pro 旋转蒸发仪（BUCHI 公司）；XSR105DU/A 型电子天平（十万分之一，梅特勒公司）；WXTS3DU 型电子天平（百万分
之一，梅特勒公司）。
1.3 HPLC 谱条件
谱柱为Aeris TM WIDEPORE XB-C 18（4.6 mm×250 mm ，3.6 µm ）；流动相A 为1.1%磷酸水溶液
（三乙胺调至pH 2.3），流动相B 为乙腈；梯度洗脱条件为：0~35 min ，18%~40% B ；35~36 min ，40%~50% B ；36~46 min ，50% B ；46~47 min ，50%~18% B ；47~55 min ，18% B ；流速为1.0 mL ·min -1；柱温为40 ℃；进样量为5 µL ； 检测波长为215 nm 。
1.4 高压制备液相谱条件
1.4.1 一次高压制备液相谱条件 谱柱填料：Sepax GP C 18（250 mm×50 mm ，5 µm ，孔径12 nm ）；流动相A 为0.2 mol ·L -1磷酸二氢铵溶液（用磷酸调至pH
2.2），流动相B 为乙腈；流速为50 mL ·min -1；
检测波长为215 nm 。梯度洗脱条件为：0~40 min ，20%~35% B ；40~41 min ，35%~60% B ；41~45 min ，60% B ；45~46 min ，60%~20% B ；46~52 min ，20% B 。收集保留时间约为27 min 的目标峰。1.4.2 二次高压制备液相谱条件 谱柱填料、流动相、流速及检测波长与“1.4.1”相同。梯度
洗脱条件：0~40 min ，30% B 。收集保留时间约为18 min 的目标峰。
1.4.3 三次高压制备液相谱条件 谱柱填料：Sepax GP C 18（250 mm×50 mm ，5 µm ，孔径12 nm ）
；
图1 生长抑素（A ）与生长抑素三硫化物（B ）的结构式
Fig.1 Structures of somatostatin （A ） and somatostatin
trisulfide （B ）
1135
第 42 卷
分析测试学报流动相A 为0.2 mol ·L -1乙酸水，流动相B 为乙腈；流速为50 mL ·min -1；检测波长为215 nm 。梯度洗脱条件为：0~15 min ，8% B ；15~16 min ，8%~50% B ；16~30 min ，50% B ；30~31 min ，50%~8% B ；31~40 min ，8% B 。收集保留时间约为21.5 min 的目标峰。
1.5 液质联用（LC-MS ）条件
谱柱：Thermo Hypersil Gold AQ （2.1 mm×150 mm ，1.9 µm ），流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈。梯度洗脱条件为：0~3 min ，5% B ；3~9 min ，5%~40% B ；9~15 min ，40% B ；15~16 min ，40%~5% B ；16~20 min ，5% B 。柱温：40 ℃；流速：0.3 mL ·min -1；进样量：1 µL （还原前供试品溶液）或10 µL （还原后供试品溶液）；检测波长为215 nm 。
离子源：电喷雾电离（ESI ）；扫描模式：正模式；扫描范围：m/z 25~2 000；雾化气流速：800 L ·
h -1；离子源温度：100 ℃；毛细管电压：2.5 kV ；锥孔电压：40 V ；碰撞能量：30~60 eV 。
1.6 溶液制备
1.6.1 生长抑素三硫化物粗品溶液制备 取适量生长抑素溶于水中，加入Na 2S 2O 3，生长抑素与Na 2S 2O 3的摩尔比为1∶2，60 ℃水浴反应1 h 后备用。
1.6.2 质谱分析样品溶液配制 还原前供试品溶液：冻干后样品经水溶解，配制成质量浓度约为1.0 mg ·mL -1的溶液。该溶液用于目标物精确分子量的测定。
还原后供试品溶液：量取上述还原前供试品溶液10 µL ，加入80 µL 水和10 µL 0.1 mol ·L -1 TCEP ·
HCl 溶液，混匀后室温下反应5 min ，用于目标物肽序列与三硫键连接位点的测定。
2 结果与讨论
2.1 生长抑素三硫化物粗品的合成
文献报道，使用硫化氢气体［15］或硫代硫酸盐［16］与蛋白质类药物反应可生成三硫化物。由于硫化氢气体有毒性且易燃易爆，不易操作，从安全角度出发，本研究首先加入硫化钠与生长抑素反应，未获得目标物。然后改用Na 2S 2O 3与生长抑素反应，发现生长抑素与Na 2S 2O 3的摩尔比为1∶2，60 ℃水浴反应1 h 后可获得生长抑素三硫化物，经HPLC 检测目标物的纯度约为10%，能够满足后期的制备
纯化要求。
2.2 生长抑素三硫化物的纯化
目前检测生长抑素三硫化物的HPLC 方法中流动相A 含有三乙胺，会与谱柱填料中的硅醇基结合，对谱柱填料产生不易逆转的影响，导致柱效下降，因此未采用其作为高压制备液相谱的流动相。本研究采用pH 2.2的磷酸二氢铵溶液作为流动相A ，乙腈作为流动相B ，经优化梯度，第一次制备纯化的谱图见图2A ，可将生长抑素三硫化物（图中保留时间为27.1 min 的峰）与其他干扰物分开。然后对该目标物进行收集与浓缩，HPLC 检测其纯度大于70%，作为二次制备纯化的供试品溶液。第二次制备纯化采用等度洗脱方法，其谱图见图2B ，对保留时间约为18.0 min 的峰进行收集浓缩，HPLC 检测其纯度大于95%，作为三次制备纯化的供试品溶液。第三次制备纯化采用易挥发的
乙酸水作为流动相A ，乙腈作为流动相B ，优化梯度后，对目标化合物进行收集浓缩，即可将
二次制备样品中的磷酸盐转为乙酸，而乙酸在
图2 生长抑素三硫化物的一次制备（A ）与二次制备（B ）谱图
Fig.2 The first preparation （A ） and second preparation （B ） chro⁃matograms of somatostatin trisulfide
1136
第 9 期王军等：生长抑素三硫化物的制备与质谱分析
浓缩与冻干步骤中可挥发去除，因此不影响下一步的质谱分析。经过冻干后，HPLC 检测其纯度大于95%，其谱图见图3。
2.3 生长抑素三硫化物的质谱分析
多肽分子由于分子量较大，通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱等进行结构解析存在困难［8］，目前多采用LC-MS 法进行分析［17-18］。本研究采用LC-MS 法对生长抑素三硫化物的精确分子量、肽序列与三硫键连接位点进行了分析，具体结果如下。
2.3.1 精确分子量的测定 由图1可知，生长抑素三硫化物的分子式为C 76H 104N 18O 19S 3，精确
的单同位素分子量为1 668.688 7。还原前供试品溶液的一级质谱图见图4，其加合离子［M+2H ］2+
的质荷比（m /z ）为835.353 9、［M+3H ］3+的m /z 为557.236 9，与生长抑素三硫化物理论计算值（［M+2H ］2+的m /z 为835.351 6、［M+3H ］3+的m /z 为557.236 9）的质量误差均小于10×10-6，表明与目标物的理论分子量相符。
2.3.2 肽序列分析 多肽药物离子化后进入质谱质量分析器和离子碰撞池，施加适当的电压和碰撞气体后，其骨架发生断裂，在ESI 源下诱导碰撞解离（CID ）后形成一系列b 离子和y 离子，再通过软件进行拼接，可得到肽段的序列［19-20］。在CID 下，一般优先引起肽骨架断裂，但不会导致二硫键断裂［21］，目前常用还原剂对二硫键还原后再进行测序［22］。有报道显示抗体药物中的三硫键在TCEP 还原下，可生成二硫键与游离巯基，其机理见图5［23］。因此，本研究使用TCEP 对生长抑素三硫化物还原后再进行肽序列测定。
还原后供试品溶液经质谱分析的总离子流图（TIC ）如图6所示，主要生成了化合物1（保留时间为
9.74 min ）与化合物2（保留时间为9.52 min ）。
其中化合物1的质谱图见图7A ，其加合离子［M+2H ］2+的m /z 为819.367 0、［M+3H ］3+
的m /z 为
546.579 1，均与生长抑素的理论计算值（［M+2H ］2+ 819.365 6、［M+3H ］3+
546.579 5）吻合，质量误差小
于10×10-6。化合物2的质谱图见图7B ，其加合离子［M+2H ］2+的m /z 为820.375 4、［M+3H ］3+的m /z 为
547.251 6，与生长抑素相比，该化合物的相对分子质量增加2 Da ，可初步判断为生长抑素线性肽
（C 76H 106N 18O 19S 2），质量误差小于10×10-6。结合图5所示反应机理，初步判断生长抑素三硫化物与TCEP 反应后生成了生长抑素（化合物1）与生长抑素线性肽（化合物2）。其中生长抑素线性肽可用于肽序列的测定，经检索后的匹配图见图8，具体b/y 离子匹配表见表1，表中加粗部分为匹配上的
离子，匹配度较高，可知样品序列为：A-G-C-K-N-F-F-W-K-T-F-T-S-C ，与生长抑素三硫化物的理论肽序列信
息相符。
图4 生长抑素三硫化物的一级质谱图
Fig.4 MS
spectrum of somatostatin trisulfide
图3 生长抑素三硫化物冻干后的谱图
Fig.3 Chromatogram of somatostatin trisulfide after freeze -dried
1137
第 42 卷
分析测试学报2.3.3 三硫键连接位点确认 目前关于二硫键的鉴定方法报道较多，包括柱后在线还原法［24］、离子源内部分还原法［25］、化学裂解法［26-27］与溶液中的试剂还原法［28］，而三硫键的鉴
定多集中在抗体类药物［15，23，29］
，多肽类
药物中的三硫键定位未见报道。本研究建立了多肽类药物中三硫键的定位方法。通过优化TCEP 与生长
抑素三硫化物的反应时间，发现在室温下反应5 min ，可将其还原为生长抑素与生长抑素线性肽。与上述文献方法相比，本方法反应时间短，无需烷基化且易于操作。通过“2.3.2”的肽序列可知，该结构中存在2个半胱氨酸，理论上只存在1对三硫键。生长抑素三硫化物与生长抑素线性肽序列的结构如图9
所示，
图6 生长抑素三硫化物还原后的总离子流图
Fig.6 Total ion chromatogram of reduced somatostatin trisulfide
表1 生长抑素三硫化物（还原后）肽序列匹配表
Table 1 Peptide sequence matching table of reduced somatostatin trisulfide
No.123456789
1011121314 b ions （calculated ）（m /z ）72.044 4
129.065 9232.075 0360.170 0474.212 9621.281 3768.349 8954.429 11 082.524 01 183.571 71 330.640 11 431.687 81 518.719 8
-
b ions （measured ）（m /z ）-*
129.066 7232.074 7360.169 4474.213 2621.282 2768.351 6954.433 01 082.527 71 183.576 31 330.646 11 431.695 71 518.727 3
-Error （×10-6）
-6.2
-1.3-1.70.61.42.34.13.43.94.55.54.9-
Sequence
A G C
K N F F W K
T F T S C y ions （calculated ）（m /z ）-1 568.702 51 511.681 01 408.671 81 280.576 91 166.533 91 019.465 5872.397 1686.317 8558.222 8457.175 1310.106 7209.059 1122.027 0
y ions （measured ）（m /z ）--
1 511.684 51 408.675 21 280.583 01 166.541 71 019.469 8872.399 9686.319 1
--
310.107 0209.058 7122.027 0
Error
（×10-6）
--
2.32.34.86.74.2
3.21.9--1.0-1.9
0.0
No.1413121110987654321
*not detected
图5 三硫化物与TCEP 还原反应机理
Fig.5 The mechanism of trisulfide reduction with TCEP
1138buchi
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