DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.003·
论著·HPLC法测定吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中
主药的含量
李岩，郭晓茹，冯文凯，刘明亮，王丹，夏桂民
【摘要】
目的建立吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量测定方法。
方法采用HPLC 法检测吉西他滨氨基甲酸酯的含量。谱条件：Inertsil ODS-SP 谱柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm），以磷酸盐缓冲液：甲醇（20:80）为流动相等度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长243 nm，柱温30 ℃，进样量20 μl。结果谱分离度R= 3.363，阴性对照无干扰；吉西他滨氨基甲酸酯在 5.81 ~ 150.00 μg/ml 范围内线性关系良好（r= 0.9999）；低、中、高 3 种浓度的平均回收率分别为98.3%（RSD = 1.77%，n = 3）、100.0%（RSD = 0.24%，n = 3）、97.8%（RSD = 0.92%，n = 3）；日内精密度RSD = 0.09% （n = 6），日间精密度RSD = 1.36%（n = 18）；流速在0.99 ~ 1.01 ml/min 范围内变化时RSD = 1.02%（n = 9），柱温在28 ~ 32 ℃ 之间变化时RSD = 0.27%（n = 9）。
结论本文建立的方法简便易行、专属性强、重复性好、准确度高、耐用性好；可定量检测吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量。
【关键词】高效液相谱；含量测定；吉西他滨氨基甲酸酯；脂质体
吉西他滨是周期特异性抗代谢嘧啶核苷类似物，通过抑制DNA 链的延长抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡[1-4]。吉西他滨是胰腺癌的一线用药[5]，也常联合其他抗癌药物用于转移性乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等[6]。自1996 年美国FDA 批准吉西他滨应用于临床以来[7]，目前仅有注射用冻干粉针剂一种剂型[8]。因吉西他滨易被脱氨酶降解失活，导致半衰期短（8 ~ 17 min），迫使吉西他滨的临床剂量较大（1000 mg/m2），由此常常带来诸多不良反应[3, 9]。
为了改善吉西他滨上述不足，经对其结构修饰，合成了新化合物吉西他滨氨基甲酸酯，并将其构建成纳米脂质体，以规避体内相关酶对其的酶解失活，延长药物半衰期，实现增效减毒。在此研究过程中，建立了吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
LC - 20A 高效液相谱仪、谱柱（C18：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，5 μm，150 mm × 4.6 mm）均购自日本岛津公司；R-300 型旋转蒸发仪购自瑞士Buchi 公司；XSE105 型分析天平购自瑞士梅特勒公司；KQ-250DB 型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；低温光照仪购自药物制剂国家研究中心。
吉西他滨氨基甲酸酯脂质体（以下简称“吉西氨脂”），自制（外观呈淡蓝乳光，粒径约90 nm，批号200920、201101 ~ 05 共6 批）；工作对照品，批号201908，99.0%，本所合成室提供；甲醇为谱纯，购自美国Fisher Scientific 公司；其他试剂均为市售谱纯或分析纯。
1.2 方法
1.2.1 对照溶液精密称取主药 2.50 mg，置于50 ml 量瓶中，加甲醇少许，超声使其完全溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2.2 供试品溶液及空白对照溶液精密量取0.1 ml 吉西氨脂悬液，置于2 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分振荡、摇匀，4 ℃、12 000 × g 条件下离心10 min，上清液即为供试品溶液。另精密量取0.1 ml 空白脂质体悬液，同法操作，得空白对照溶液。
1.2.3检测法以Inertsil ODS-SP（5 μm，150 mm × 4.6 mm；十八烷基硅烷键合硅胶）为谱柱；以
基金项目：国家重点研发计划（2016YFA0201504）；国家自然科学基金（81673383、81803479）
作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所制剂室
通信作者：夏桂民，Email：*****************
收稿日期：2020-12-21
pH（2.5 ± 0.1）磷酸盐缓冲液：甲醇（20:80）为流动相等度洗脱；检测波长为243 nm；柱温为30 ℃；进样体积为20 μl。
1.2.4系统适用性试验分别取“1.2.1”和“1.2.2”项下对照溶液、供试品溶液及空白对照溶液适量，照“1.2.3”项下谱条件操作，记录谱图。
1.2.5破坏性试验分别取吉西氨脂悬液、空白脂质体悬液、对照溶液各 5 份，进行以下破坏性试验。
1.2.5.1酸破坏精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，加入 1 mol/L 盐酸溶液0.5 ml，室温下避光放置12 h，按“1.2.2”项下方法操作，得酸破坏供试品溶液。同法操作，得酸破坏空白对照溶液及酸破坏对照溶液。
1.2.5.2碱破坏精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入1 mol/L 氢氧化钠溶液0.5 ml，余下同“1.2.5.1”，得碱破坏供试品溶液、碱破坏空白对照溶液及碱破坏对照溶液。
1.2.5.3氧破坏精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入3% 过氧化氢溶液0.5 ml，室温下避光放置 3 h。按“1.2.2”项下方法操作，得氧破坏供试品溶液。同法操作，得氧破坏空白对照溶液及氧破坏对照溶液。
1.2.5.4光破坏精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入5% 葡萄糖溶液0.5 ml，在低温光照仪［（4500 ± 500）lx］中照射 4 h。按“1.2.2”项下方法操作，得光破坏供试品溶液。同法操作，得光破坏空白对照溶液及光破坏对照溶液。
1.2.5.5高温破坏精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入5% 葡萄糖溶液0.5 ml，在65 ℃水浴中避光加热8 h。按“1.2.2”项下方法操作，得高温破坏供试品溶液。同法操作，得高温破坏空白对照溶液及高温破坏对照溶液。
1.2.6线性与范围精密称取对照品适量，置于50 ml 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，再用甲醇依次递倍稀释，得8 种不同浓度的主药溶液（浓度范围为 5.81 ~ 150.00 μg/ml）。照“1.2.3”操作，记录峰面积。
1.2.7检测限与定量限精密量取吉西氨脂悬液适量，用5% 葡萄糖溶液递倍稀释，照“1.2.2”处理样品，照“1.2.3”操作，记录谱图，分别以信噪比为3:1 和10:1 时相应的主药的量为检测限和定量限。
1.2.8重复性试验取同一供试品 6 份，照“1.2.3”操作，记录峰面积。
1.2.9精密度试验取同一供试品，照“1.2.3”操作，同一天内连续进样 6 次，记录峰面积。另取同一份供试品，连续 6 天，每天同法操作，记录峰面积。
1.2.10回收率试验精密称取主药 5.50、5.00、4.50 mg 各3 份，分别置于50 ml 量瓶中，加甲醇适量并超声使其完全溶解，再加空白脂质体悬液5 ml，用甲醇定容至刻度，摇匀，4 ℃、12 000 × g 条件下离心10 min，得低、中、高 3 种不同浓度的供试品溶液。照“1.2.3”项下条件，分别进样，记录谱图，按外标法计算得主药浓度，再与理论值对比，每个浓度平行测定 3 次，得平均回收率。
1.2.11耐用性试验
1.2.11.1流速变化的影响将流速分别设置为0.99、1.00、1.01 ml/min，取同一供试品溶液，照“1.2.3”项下条件，记录峰面积。
1：吉西他滨氨基甲酸酯；a：吉西氨脂；b：溶媒；c：空白脂质体；d：对照溶液
1: Carbamate-gemcitabine; a: Gemcitabine carbamate-loaded liposomes; b: Solvent; c: Blank liposomes; d: Carbamate-gemcitabine reference substance 图 1系统适用性谱图
Figure 1Chromatograms of system suitability
1.2.11.2 柱温对系统的影响将柱温分别设置为28、30、32 ℃，取同一供试品溶液，照“1.2.3”项下条件，记录峰面积。
1.2.12含量测定取连续 5 批吉西氨脂，分别按“1.2.2”及“1.2.3”操作，记录谱图，照外标法计算各批次供试品中主药的浓度。2 结果
2.1 系统适用性
在对照溶液及供试品溶液中，主药的保留时间均约为11.323 min，分离度均为 3.363。空白脂质体谱图中相应保留时间处未见吸收峰（图1）。上述结果表明在已建立的谱条件下，吉西氨脂的辅料对主药的分析检测无干扰。
A
B
C
D
E
F
1：吉西他滨氨基甲酸酯；a：空白脂质体；b：吉西氨脂；c：对照溶液
1: Carbamate-gemcitabine; a: Blank liposomes; b: Gemcitabine carbamate-loaded liposomes; c: Carbamate-gemcitabine reference substance
图 2破坏性试验谱图（A：酸破坏；B：碱破坏；C：氧破坏；D：光破坏；E：高温破坏；F：未破坏）
Figure 2Typical chromatograms of destructive test [Destruction by acid (A); by base (B); by oxidation (C); by illumination (D); by high temperature (E); nondestruction (F)]
2.2 专属性
分别取各待测破坏溶液，照“1.2.3”项下条件进样，记录谱图（图2）。结果表明，吉西他滨氨基甲酸酯谱峰与酸、碱、光、高温破坏产生的降解产物谱峰均能有效分离，说明本方法专属性良好。氧破坏试验组均未检测出吉西他滨氨基甲酸酯谱峰，表明其对氧不稳定。
2.3 线性与范围
以主药峰面积A 为纵坐标、浓度 C 为横坐标进行线性回归，得回归方程：A = 34569 C + 22727，r = 0.9999。说明在5.81 ~ 150.00 μg/ml 范围内主药浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 检测限与定量限
经检测，主药的检测限为 5.2 ng（S/N = 3），定量限为16.8 ng（S/N = 10）。
2.5 重复性
取同一供试品 6 份，照“1.2.3”操作，经统计，重复性实验的RSD = 1.39%（n = 6）（表1）。
2.6 精密度
经统计日内精密度RSD 为0.09%（n = 6），日间精密度RSD 为 1.36%（n = 18）（表 2 和表3）。
表 1重复性试验结果
Table 1Result of reproducible test
样品序号
Sample No.
平均浓度（μg/ml）（n = 3）
Mean concentration (μg/ml) (n = 3)
RSD（%）
（n = 6）
1 915.83 1.39
2 909.54
3 939.96
4 910.23
5 926.91
6 930.55
表 2日内精密度
Table 2Intra-day precision
批号
Lot number
峰面积
Peak area
RSD（%）
（n = 6）20200920 1453223，1451874，1452262 0.09
1450198，1450212，1450226
2.7 回收率
统计求得低、中、高 3 个加样平均回收率为98.3%（RSD = 1.77%，n = 3）、100.0%（RSD = 0.24%，n = 3）和97.8%（RSD = 0.92%，n = 3）（表4）。
2.8 耐用性
流速在0.99 ~ 1.01 ml/min范围内变化时，RSD 为1.02%（n = 9），说明该方法的耐用性良好
表 3 日间精密度Table 3Inter-day precision
天数（d）Days (d)
峰面积
Peak area
平均峰面积（n = 3）
Mean peak area (n = 3)
RSD（%）
（n = 18）
1 1449693，1447893，1445281 144762
2 1.36
2 1440881，1440361，1439932 1440391
3 1429156，1424956，142266
4 1425592
4 1432155，1431252，143097
5 1431461
5 1482551，1481215，148093
6 1481567buchi
6 1444299，1444093，1443492 1443961
表 4回收率试验结果
Table 4Recovery results
理论浓度（μg/ml）Theoretical concentration (μg/ml)
实测浓度（μg/ml）
Calculated concentration (μg/ml)
平均回收率（%）
Mean recovery (%)
RSD（%）
（n = 3）
90.60 89.79
91.20 90.82
91.80 88.46
98.3 1.77
100.40 100.64
100.80 100.57
100.20 100.13
100.0 0.24
109.80 106.26
110.00 107.73
112.00 110.38
97.8 0.92
表 5耐用性试验结果Table 5Robustness results
变化参数Running parameter
峰面积
Peak area
均值（n = 9）
Overall mean (n = 9)
RSD（%）
（n = 9）
流速（ml/min）0.99 1585677，1584135，1582619
Flow rate (ml/min) 1.00 1568128，1567019，1567539
1.01 1554026，1551266，1551033
1567938 1.02
柱温（℃）28 1558803，1557037，1557157
Column temperature (℃)30 1569174，1561058，1557465
32 1557465，1553739，1551727
1558181 0.27
表 6 5 批吉西氨脂含量测定结果
Table 6Content determination
批号Batches
浓度（μg/ml）（n = 3）Concentration (μg/ml) (n = 3)
201101 978.83
201102 942.95
201103 931.72
201104 956.71
201105 947.89
（表5）。柱温在28 ~ 32 ℃之间变化时，RSD 为0.27%（n = 9），说明此条件下对主药含量测定结果影响较小。
2.9 含量测定
5 批供试品含量测定结果见表6。
3 讨论
建立了HPLC 法用于吉西氨脂中主药含量的测定，通过系统的方法学研究与验证，认为本法操作简便、专属性好、准确度高，适合于吉西氨脂中主药的含量测定。
3.1 药物稳定性的影响因素
破坏性试验结果提示，吉西他滨氨基甲酸酯在酸（pH 1盐酸溶液，12 h）、碱（pH 13氢氧化钠溶液，12 h）、光照（4500 ± 500 lx，4 h）、高温（65 ℃，8 h）条件下，未检测出主药谱峰，说明主药被完全破坏。但吉西氨脂在上述酸、碱、光照、高温条件下，均能检测出主药谱峰，并且能够与所产生的降解产物谱峰有效分离，表明脂质体能提高吉西他滨氨基甲酸酯在酸、碱、光照、高温条件下的稳定性。同时，在已建立的谱条件下，本方法专属性良好。
3.2 谱条件的选择
本课题组制备了一系列吉西他滨衍生物，参照前期确定的梯度洗脱谱条件，发现主药峰与杂质峰不能完全分离，分离度仅为 1.12（< 1.5），为了实现杂质与主药的有效分离，本研究尝试改变流动相比例，最终发现磷酸缓冲盐：甲醇（pH 2.4 ~ 2.5）= 20:80 等度洗脱时，主药峰与杂质峰能够有效分离，峰形对称，分离度为 3.363，保留时间适宜（11.323 min）。本研究在现有方法的基础上，改进并建立了更加简便、准确的谱分析条件。
参考文献
[1]Peng YF, Guo J, Yang QX, et al. Research advances in the anti-umor
activities of gemcitabine derivatives. Prog Pharm Sci, 2018, 42(7): 544-550. (in Chinese)
彭炎福, 郭靖, 杨秋星, 等. 吉西他滨衍生物抗肿瘤活性的研究进展. 药学进展, 2018, 42(7):544-550.
[2]Miao H, Chen X, Luan Y. Small molecular gemcitabine prodrugs for
cancer therapy. Curr Med Chem, 2020, 27(33):5562-5582.
[3]Zhao D, Chen J, Chu M, et al. Prolonged low-dose infusion for
gemcitabine: a systematic review. Onco Targets Ther, 2019, 12:4859- 4868.
[4]Neutsch L, Wirth EM, Spijker S, et al. Synergistic targeting/prodrug
strategies for intravesical drug delivery-lectin-modified PLGA microparticles enhance cytotoxicity of stearoyl gemcitabine by contact-dependent transfer. J Control Release, 2013, 169(1-2):62-72.
[5]Abu-Fayyad A, Nazzal S. Gemcitabine-vitamin E conjugates:
Synthesis, characterization, entrapment into nanoemulsions, and in-vitro deamination and antitumor activity. Int J Pharm, 2017, 528(1-2):463-470.
[6]Fang J, Nakamura H, Maeda H. The EPR effect: Unique features of
tumor blood vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect. Adv Drug Deliv Rev, 2011, 63(3):136-151.
[7]Eckel F, Schneider G, Schmid RM. Pancreatic cancer: a review of
recent advances. Expert Opin Investig Drugs, 2006, 15(11):1395- 1410.
[8]Singh A. A review on gemcitabine modification. Mater Today Proc,
2020, 37(2):3301-3304.
[9]Moysan E, Bastiat G, Benoit JP. Gemcitabine versus modified
gemcitabine: a review of several promising chemical modifications.
Mol Pharm, 2013, 10(2):430-444.
发布评论