一、 目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜深
一、 目的
掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。
二、原理
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显反应由酪氨酸、氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、氨酸含量不同而使显强度稍有不同。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）
2．仪器
（1）722 型（或721 型）分光光度计
（2）4 000r/min 的离心机
掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。
二、原理
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显反应由酪氨酸、氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、氨酸含量不同而使显强度稍有不同。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）
2．仪器
（1）722 型（或721 型）分光光度计
（2）4 000r/min 的离心机
（3）分析天平
（4）容量瓶（50mL）
（5）量筒
（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）
3．试剂（纯度均为分析纯）
（1）0. 5mol/L NaOH
(2) 试剂甲：
（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。
（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将（A）液50 份与（B）液1 份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。
（3）试剂乙：
在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠（Na化学实验报告2WO4·2H2O）和700mL 蒸馏水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，
（4）容量瓶（50mL）
（5）量筒
（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）
3．试剂（纯度均为分析纯）
（1）0. 5mol/L NaOH
(2) 试剂甲：
（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。
（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将（A）液50 份与（B）液1 份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。
（3）试剂乙：
在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠（Na化学实验报告2WO4·2H2O）和700mL 蒸馏水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，
冷却后溶液呈黄（倘若仍呈绿，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕试剂瓶中保存，使用前大约加水1 倍，使最终浓度相当于1mol/L。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作
（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL 的牛血清白蛋白溶液。
（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通试管，按表1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显程度减弱）。30min 后，以不含蛋白质的1 号试管为对照，用722 型分光光度计于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作
（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL 的牛血清白蛋白溶液。
（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通试管，按表1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显程度减弱）。30min 后，以不含蛋白质的1 号试管为对照，用722 型分光光度计于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。
（1）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。
2．样品的提取及测定
（1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL 蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管，离心4 000r/min、20min。将上清液转入50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。
（2）取普通试管2 支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm 波长下测定光密度，并记录结果。
五、结果计算
计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。
六、附注
（1）进行测定时，加Folin 试剂要特别小心，因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10 的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin 试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显程度减弱。
（2）本法也可用于游离酪氨酸和氨酸含量测定。
七、思考题
1．含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝反应？
2．测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显法以外，还可以用什么方法？
参考答案
1．含有酚基的氨基酸（酪氨酸、氨酸、苯丙氨酸）能与Folin-酚试剂反应呈蓝，因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝化合物（钼兰和钨兰混合
计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。
六、附注
（1）进行测定时，加Folin 试剂要特别小心，因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10 的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin 试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显程度减弱。
（2）本法也可用于游离酪氨酸和氨酸含量测定。
七、思考题
1．含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝反应？
2．测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显法以外，还可以用什么方法？
参考答案
1．含有酚基的氨基酸（酪氨酸、氨酸、苯丙氨酸）能与Folin-酚试剂反应呈蓝，因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝化合物（钼兰和钨兰混合
物）。
2．除Folin-酚试剂显法以外，紫外吸收法也可以进行蛋白质含量的测定。蛋白质在280nm 下具有最大的吸收值，这是由于含有酪氨酸、氨酸、苯丙氨酸所引起的。若将已知不同浓度的蛋白质在280nm 处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。
2．除Folin-酚试剂显法以外，紫外吸收法也可以进行蛋白质含量的测定。蛋白质在280nm 下具有最大的吸收值，这是由于含有酪氨酸、氨酸、苯丙氨酸所引起的。若将已知不同浓度的蛋白质在280nm 处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。
蛋白酶活力的测定
一、实验目的
1、了解碱性蛋白酶活力测定的原理；
2、掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理
蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质
量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验步骤
1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1,A0,B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min(准确计时)后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、奖试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
三、实验试剂
① 微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）:称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；
② 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5）；
③ 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；
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