ＩＳＳＮ１００６－７１６７
ＣＮ３１－１７０７／Ｔ
ＲＥＳＥＡＲＣＨＡＮＤＥＸＰＬＯＲＡＴＩＯＮＩＮＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
第４０卷第１期 Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１
２０２１年１月Ｊａｎ．２０２１
ＤＯＩ：
１０．１９９２７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｓｙｙｔ．２０２１．０１．００６
高通量测序技术在水生态污染监测中的应用
景 明， 陈
瑜， 高 昕， 李继影
（江苏省苏州环境监测中心，江苏苏州２１５０００）
摘 要：针对张家港某河道水异常事件，通过高通量测序技术结合显微镜鉴定结果，判断引起河道生态污染的微生物种类，并分析引起该事件的原因。通过Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序，对河道的原核生物及真核生物分别进行测序，真核生物量较多且落组成较为单一，原核生物量相对较少且落分布较为均匀，与显微镜检测结果一
致。对获得的ＯＴＵ进行物种注释，得到引起河道生态污染的主要微生物为
Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ。本研究为水生态监测提供了新的视角，也证明高通量测序技术在水生态监测中具有较好的应用潜力。关键词：高通量测序；真核生物；原核生物
中图分类号：Ｘ８３５ 文献标志码：Ａ 文章编号：
１００６－７１６７（２０２１）０１－００２７－０５ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎ
ＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆＷａｔｅｒＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＰｏｌｌｕｔｉｏｎ
ＪＩＮＧＭｉｎｇ， ＣＨＥＮＹｕ， ＧＡＯＸｉｎ，
ＬＩＪｉｙｉｎｇ
（
ＪｉａｎｇｓｕＳｕｚｈｏｕＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５０００，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｆｏｃｕｓｅｓｏｎｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｗａｔｅｒｃｏｌｏｒｉｎａｒｉｖｅｒｉｎＺｈａｎｇｊｉａｇａｎｇ．Ｔｈｅｒｅａｓｏｎｆｏｒａｂｎｏｒｍａｌｗａｔｅｒｏｆｔｈｅｒｉｖｅｒｉｓｏｕｔｂｒｅａｋｏｆａｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｙｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｃａｕｓｅｓｏｆｔｈｉｓｅｖｅｎｔｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｅｓｉｎｔｈｅｒｉｖｅｒｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｙＩｌｌｕｍｉｎａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｒｉｃｈ
，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｄｏｍｉｎａｎｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｓｓｍａｌｌ，ｈｏｗｅｖｅｒ，
ｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｓｖｅｒｙｓｉｍｐｌｅａｎｄｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｒｅｓｕｌｔｓ．
ＯＴＵｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌｌｙｃｌａｓｓｉｆｉｅｄａｎｄｔｈｅ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｔｈａｔｃａｕｓｅｔｈｉｓｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎｗａｓＰｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｗｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｆｏｒｗａｔｅｒｅｃｏｌｏｇｙｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｄｐｒｏｖｅｓｔｈａｔｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｇｒｅａｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｗａｔｅｒｅｃｏｌｏｇｙｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｅｕｋａｒｙｏｔｅ；
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ
收稿日期：
２０２０ ０６ ０８基金项目：２０１８年度江苏省环境监测科研基金项目（１８１０
）作者简介：景
明（１９８６－
），男，江苏苏州人，硕士，工程师，研究方向为环境生态监测。Ｔｅｌ．：０５１２ ６８３３８０４１；Ｅ ｍａｉｌ：ｊｉｎｇ＿ｍ２０１２＠ｓｉｎａ．ｃｎ通信作者：李继影（１９８０－
），女，安徽阜南人，高级工程师，研究方向为湖泊水生态。Ｔｅｌ．：０５１２ ６８３３８０１２；Ｅ ｍａｉｌ：
ｌｉ＿ｊｉｙｉｎｇ＠ｑｑ．ｃｏｍ
０
引
言 张家港位于江苏省苏州市，区域范围内水系发达，随着区域经济发展，人类活动一定程度上影响了河道
水质。本研究主要针对张家港某生态污染河道河水呈赤红，经显微镜初步鉴定发现该现象是由微生物爆发导致的生态污染事件。微生物是指示水生态环境变化的敏感指标［１
］。目前，微生物分类主要依靠光学根
据细胞的形态结构特征确定其种类［２
］。但显微镜检测适用于鉴定细胞体积较大，具有显著形态学的大型细胞，对于部分个体较小的细胞无法有效鉴定［３
］。
第
４０卷 随着基因测序技术不断地发展与普及，大数据分
析能力不断提高，基因组研究手段正越来越多地应用
于鉴定形态学难以辨别的物种［４
］。原核生物和真核
生物的基因组都含有保守区和可变区，其中可变区能够区分物种之间的差异，适用于进行测序和分类鉴定，是研究环境样品中微生物物种落的重要手段。目前高通量测序技术已经广泛应用于研究蓝藻水华的形成及其爆发原因的机理。本研究通过Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序对该河道的原核生物及真核生物分别进行测序，分析其落结构及成因。
１
材料与方法
１．１
样品采集及前处理
本次采样地点为张家港污染河道（坐标为
１２０°３８′１５．４３Ｅ，３１°４８′３２．１１Ｎ），采样时间２０１９ １２
２３，每个采样点使用垂直采样器在水面下０．５ｍ处收集５Ｌ水样，储存在塑料瓶内，置于４℃冷
藏箱后运回实验室，在２４ｈ内完成水样中微生物的富集。采用标准方法［５
］测定以下常规水质指标：叶绿素ａ、氨氮、总磷、总氮、化学需氧量、度和ｐＨ。样品浓缩采用膜过滤法，将样品通过醋酸纤维素滤膜（孔径０．４５μｍ、直径５０ｍｍ），用ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）对滤膜进行洗脱。然后将洗脱液进行高速离心浓缩（１４０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）
，最后去掉上层清液，用１ｍＬＰＢＳ进行洗脱，然后进行ＤＮＡ提取。１．２ ＤＮＡ提取及高通量测序
ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ［６］法标准化操作流程，然后采用琼脂糖凝胶电泳进行ＤＮＡ浓度和纯度检测。最后取适量的样本ＤＮＡ于
离心管中，使用无菌水稀释样本至１ｎｇ／μＬ作为基因组ＤＮＡ模
板。根据待测序区域的选择，使用带Ｂａｒｃｏｄｅ的特异引物（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ公司的Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ
ｗｉｔｈＧＣＢｕｆｆｅｒ）和高效高保真酶进行ＰＣＲ，
确保扩增效率和准确性。本研究选择针对原核生物１６ＳｒＲＮＡ
基因中高度变化的Ｖ４区域［７
］以及真核生物１８ＳｒＲＮＡ
的Ｖ４区域［８
］的引物作为扩增子，详见表１。ＰＣＲ的反应条件为：９５℃５ｍｉｎ，９４℃６０ｓ，５７℃４５ｓ，７２℃６０ｓ，共３４个循环，最后７２℃终延伸１０ｍｉｎ，１６℃５
ｍｉｎ。ＰＣＲ产物通过２％的琼脂凝胶电泳检测。根据
ＰＣＲ产物的浓度对样品进行等量混合，然后使用１×ＴＡＥ浓度２％的琼脂糖胶电泳对ＰＣＲ产物进行纯化，将剪切得到的目标条带使用试剂盒回收产物，试剂盒为ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
公司ＧｅｎｅＪＥＴ胶回收试剂盒。 使用建库试剂盒（
ＩｏｎＰｌｕｓＦｒａｇｍｅｎｔＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ４８ｒｘｎｓ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）
进行文库的构建，构建好的文库经过Ｑｕｂｉｔ定
量和文库检测合格后，进行上机测序（ＩｏｎＳ５ＴＭ
ＸＬ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）
。
１ ＰＣＲ１．３
使用Ｃｕｔａｄａｐｔ［９
］先对原始数据的ｒｅａｄｓ进行低质量部分剪切，去掉干扰数据，再根据Ｂａｒｃｏｄｅ从处理后的数据中拆分出各样品数据，然后进行去除嵌合体序列处理，即对截去Ｂａｒｃｏｄｅ和
引物序列初步质控得到原始数据
Ｒｅａｄｓ序列［１０
］通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列［１１
］，得到最终的有效数据（ＣｌｅａｎＲｅａｄｓ）
。用
Ｕｐａｒｓｅ软件［１２
］对样品进行聚类分析，以９７％的一致性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）将序列聚类成为ＯＴＵｓ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ
ＴａｘｏｎｏｍｉｃＵｎｉｔｓ），选取ＯＴＵｓ中出现频数最高的序列作为ＯＴＵｓ的代表序列。对ＯＴＵｓ序列进行物种注释，用ＲＤＰＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ方法与Ｓｉｌｖａ１３２数据库进行物种注释分析（设定阈值为０．６～１．０）。使用ＭＵＳＣＬＥ软件
进行快速多序列比对，得到所有ＯＴＵｓ序
列的系统发生关系。最后，以样品中数据量最少为标准对测序数据进行均一化处理，后续的Ａｌｐｈａ多样性分析和Ｂｅｔａ多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
２
结果与分析
２．１ water pollution
测序数据分析及多样性指数本次扩增的第１轮ＰＣＲ扩增产物如图１所示，所扩增的基因片段条带单一，长度分别约为３００ｂｐ及
３５０ｂｐ，
真核生物的生物量显著高于原核生物。（
ａ）１６ＳｒＲＮＡ
（
ｂ）１８ＳｒＲＮＡ图１ 扩增产物电泳图
测序共获得１６ＳｒＲＮＡ基因Ｖ４可变区的８８９６８
条原始序列，通过数据筛选后共得到８０１４８个高质量序列；１８ＳｒＲＮＡ基因Ｖ４可变区的８８５１０条原始序列，通过数据筛选后，共得到８７８４１个
高质量序列。８
２
第
１期景 明，等：高通量测序技术在水生态污染监测中的应用 将序列进行随机抽样，并通过对所抽到的序列数和代表的
ＯＴＵ数来构建稀释性曲线，如图２所示。由图可知，原核生物得到的注释为５４８种ＯＴＵ，
真核生物得到的注释为３３种，两个样品的稀释曲线趋于平坦，说明原核生物与真核生物的测序结果都较为完整，原核生物的物种分布较为均匀种组成较为丰富；真核生物的种组成比较单一
。
（ａ）原核生
物
（ｂ）真核生物
图
２ ＯＴＵｓ
稀释曲线
对不同样本在９７％一致性阈值下的Ａｌｐｈａ
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ分析指数进行统计，结果见表２（均一化时选取的数据量：ｃｕｔｏｆｆ＝６５４４６（原核生物）；ｃｕｔｏｆｆ＝
７９９３９（真核生物））。Ｓｈａｎｎｏｎ Ｗｉｅｎｅｒ指数和Ｓｉｍｐｓｏｎ指数表示个体分布
的均匀度，各物种之间个体分布越均匀，指数越高，如果每一个体都属于不同的物种，指数则达到极值，由表可知真核生物的物种组成比原核生物单一。
表２ ＡｌｐｈａＩｎｄｉｃｅｓ
统计表
２．２ 原核生物的多样性和落结构分析对样品中的原核生物ＯＴＵｓ进行注释后发现，本次样品原核生物多样性丰富，涵盖了２２门７４种。其中
，变形菌门（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）２１种，占５４．５％；拟杆菌门
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）２４种，占１５．７７％；放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）
１种
，占１２．３７％：厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）１５种，占８．１９％，如图３所示。原核生物ＯＴＵｓ前６的属占总测序量的百分比见表３，６个属
ＯＴＵｓ总百分比仅为３２．１８％，表明原核生物种类分布较为均匀。
图３ 原核生物门水平上的物种相对丰度饼状图
３ ６２．３
真核生物的多样性和落结构分析
对
所得到真核生物的ＯＴＵｓ序列进行物种注释后发现，本次采集的样品中真核生物种类比较单一，共发现４个门１２种，其中金藻门（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）占９３．９５％，
如图４所示，样品中核心ＯＴＵ是Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａ
ｅｎｃｙｓｔａｎｓ占９３．９４％，３种微生物占真核生物的９５％以上（见表４）
。图４ 真核生物门水平上的物种相对丰度饼状图
９
２
第
４０卷
４ ３
５状，游动速度较快。且棒状藻体中含５～１０个颗粒状素体。几乎所有的可见细胞均为该微生物，细胞颜为紫红，水体中大量出现，导致河道水面呈现为紫红，形态学鉴定无法准确判断该微生物种类。 根据高通量测序结果中真核生物和原核生物生物量以及物种丰度的
区别，导致本次河道生态污染的微
生物为Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ。筛
选真核生物中特别关注的物种（相对丰度前
１０的种）进行物种分类树统计，进行展示，其物种分类树如图６所示。
图５ 显微镜观察结果
图６ 样
本中特定物种分类树３
讨
论３．１
高通量测序技术的应用该河道微生物的优势种个体较小，通过显微镜难以准确判断其类别，而高通量测序技术具有能够检测
数量较少、体积微小且不宜培养的微生物的能力
［１３
］，用于检测环境样品中微生物落结构的生物多样性［４
］。目前江苏省浮游藻类监测主要建立在形态学鉴定的基础上，本研究采用高通量测序技术对河道原核生物及真核生物的落组成进行研究，同时结合形态学检测结果，发现引起本次河道生态污染的微生物为一种体积较小，难以通过传统显微镜鉴定种类的真核浮游藻类。高通量测序技术可以弥补显微镜观察中
难以判断的物种信息，从而提高了浮游藻类监测的综
合能力［１４
］。３．２ 水环境因子对生物落结构的影响本研究中，河道的水质参数如表５所示。由表５
可知，该河道水体属于劣５类水体，相比其他指标化学需氧量浓度较低（
５类水４０ｍｇ／Ｌ），氨氮（５类水２．０ｍｇ／Ｌ）与总磷（５类水０．４ｍｇ／Ｌ）浓度较高，均超过５
类水要求５倍以上，可生化性较差（可生化处理的水质推荐的碳氮比为１００∶５，该河道碳氮比为１∶１，推测有工业废水排入），对活性微生物繁殖造成影响，致使水体的自净能力得到影响，当有少数微生物能够适应该水质条件时，该微生物易成为优势种。
０
３
第１期
景 明，等：高通量测序技术在水生态污染监测中的应用
５
３．３ 优势种Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ
金藻是生态学和生态生理学的原生模式种，一部分种类是水体中的初级生产力，另一部分是水体中部分细菌的捕食者，通常最佳生长条件为温度较低，透明度较好且有机物含量较低的水体［１５］，在初春、晚秋或冬季多有发现，多数存活于水体的中下层，有研究表明在冰面下某些金藻种类仍能存活［１６］。
近几年，系统发育树和大系统分类学显示了金藻门所包含种类的复杂性，许多种类为光合自养和异养生物之间的过渡［１７］，其中异养型金藻与自养型金藻相比，具有较小的基因组和细胞体积，相对表面积较大，能够高效利用环境中的营养盐且所需代谢时间短于其它藻类。Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ属于金藻纲（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ），金藻目（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ），
Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ科，Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａ属，属于一种异养型微型浮游藻类［１５］，细胞无细胞壁，仅含有一条鞭毛，
Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ在中国发现较少，在已有研究中有报道，当水质的可生化性较差时，自养型微生物难以
生存的条件下该种类易成为优势种［１８］。
４ 结 论
本研究结果表明，运用高通量测序技术结合形态学鉴定能够揭示水环境中微生物的多样性及落组成，得到更客观、更准确的监测结果，在水生态监测和水质评价方面具有较好的应用潜力。
（１）对张家港生态污染河道进行形态学鉴定，落组成单一，可见的微生物基本为同一种类。（２）用高通量测序技术对１８ＳｒＲＮＡ基因Ｖ４区测序，结果显示数量较多且落组成单一，
Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ占９３．９４％。用高通量测序技术对１６ＳｒＲＮＡ基因Ｖ４区测序，结果显示数量相对较
少且落分布较为均匀，由此得出主要的微生物为
Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ。
（３）对该河道水质进行分析，推测该河道有工业废水混入，可生化性较差，同时冬季河道水质不利于常规藻类生长，使得Ｐｅｄｏｓｐｕｍｅｌｌａｅｎｃｙｓｔａｎｓ成为优势种，导致了本次河道生态污染事件。
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１３
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