两株马铃薯干腐病病原菌的分离和鉴定
李凤兰1蒋先锋1史丽娟1韩锋1魏琪2
冯艳忠2闵凡祥2郭梅2李学湛2
（1东北农业大学生命科学学院，150030，黑龙江哈尔滨；2黑龙江省农业科学院，150086，黑龙江哈尔滨）
摘要确定马铃薯窖储主要真菌病害马铃薯干腐病的致病菌株，为科学防治提供依据。从黑龙江省哈尔滨地区具有典型马铃薯干腐病症状的薯块中分离获得了2个镰刀菌菌株，通过生物学特征、致病性测定和ITS序列分析进行鉴定。根据测定菌株的生长速度、菌丝形状、菌落泽、基物表面泽等初步确定2个致病菌株为黄镰刀菌(F．culmorum)和燕麦镰刀菌(F．avenaceum)，两菌株对离体块茎的致病率分别为41.05%和72.20%。2个菌株的ITS序列与GeneBank中的黄镰刀菌和燕麦镰刀菌的完全一致，相似度均达到100%，也验证了依据传统特征的鉴定结果。明确了黄镰刀菌为我国马铃薯干腐病的致病菌。
关键词马铃薯干腐病；镰刀菌;ITS；分子鉴定
马铃薯是世界性的高产作物，其经济价值在世界作物中占第4位，中国是世界上马铃薯种植作者简介：李凤兰，副教授，研究方向为植物病理学
李学湛为通信作者，研究员，研究方向为马铃薯病害防治基金项目：国家自然基金青年科学基金(31201470)；中加国际合作项目(2011DFA30760)；国家自然科学基金(J1210069);
黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511061)
收稿日期:2013－04－19；修回日期:2013－05－17面积最大的国家［1］。黑龙江省是马铃薯的主要种植区，常年种植面积达到40万hm2，年产鲜薯500万t左右，占全国的10%左右。由于北方气候比较寒冷，往往收获的马铃薯需要进行长时间的窖储（可以达到半年之久），因此，窖储的质量直接影响到北方地区马铃薯的商品价值。马铃薯镰刀菌干腐病是马铃薯长时间贮藏的主要病害之一，这种真菌病害可以导致薯块高度腐烂。即使是进入市场上销售时，也会出现严重的腐烂现象，损失量最高可以达到50%以上，给我国马铃薯生产带来了巨大的经济损失［2］。
镰刀菌在自然界中分布广泛，通过研究发现镰刀菌分生孢子、分生孢子座、产孢细胞形态及培养性状等方面具有多样性，易受环境影响产生变异，因此，鉴定和识别不同镰刀菌种类比较复杂和困难。但随着分子生物学的发展，采用分子检测技术与传统形态学鉴定相结合的方法，可以快速、准确鉴定镰刀菌种类。目前，真菌核酸序列的分子检测研究几乎都集中在rDNA基因上，因为rD-NA存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，同时客观存在的不同区域进化水平不同，可以用于不同分类等级的研究［3］。此外，rDNA
櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓櫓
序列phenomenon：the shorter the co－growth stage was，the larger LER was；compared with the maize monoculture，the grain amount and100-grain weight of maize intercropped with garlic、cabbage and pea was significantly increased；though100-grain weight of maize intercropped with soybean was significantly increased，but its grain amount was not significantly increased；the yield factor of maize intercropped with linseed and wheat was also increased，but was not significant；the biomass accumulation of maize in every patterns was the logistic growth model，compared with the maize monoculture，the biomass accumulation of intercropped maize was higher than monoculture from66to86days after maize sowing，in soybean/maize intercropping，the biomass accumulation of intercropped maize was always be-low in the co－growth stage．the turning point of biomass accumulation of intercropped maize appear in the106th，86th，75th day after sowing in pea/maize、wheat/maize，and linseed/maize intercroppings．
Key words Maize；Intercropping pattern；Yield；Biomass；Land equivalent ratio
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分析的最大特点是病原菌的rDNA在ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有差异，所以最能反映菌株间的遗传关系［4－5］。本试验从黑龙江省哈尔滨地区分离获得了2株马铃薯干腐病的致病菌，对其进行了常规鉴定和致病性试验，同时进行了rDNA-ITS的基因片段克隆和序列分析，为揭示黑龙江省马铃薯干腐病的致病菌，科学防治马铃薯镰刀菌病害提供理论依据，同时为完善马铃薯干腐病病原菌的分子检测鉴定技术提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
2010年3月从哈尔滨周边的贮藏窖中取得具有明显干腐病症状的薯块30个作为病菌分离材料。本试验所采用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），马铃薯蔗糖琼脂（PSA），水琼脂（WA），米饭培养基，Joffe修改的Bilai’s培养基等［6］。
1.2试验方法
1.2.1镰刀菌的分离和常规鉴定镰刀菌的分离和纯化主要是按照宗兆锋等［7］的方法进行。病原菌的常规鉴定方法主要参照闵凡祥等［8］的鉴定方法进行，主要是根据菌株在PSA培养基上生长速度、
菌丝形状、菌落泽、基物表面泽、在米饭和Bilai’s上培养的综合颜等。主要参照参考文献［9］，Booth［10］分类系统的描述、图谱及检索表及John等［11］有关镰刀菌鉴定方法进行对比鉴定，根据综合性状确定不同镰刀菌种类。
1.2.2病原菌致病性测定病原菌致病性测定的方法是按照魏周全等［12］的方法进行，选用的马铃薯品种为易感病的Atlantic，每个试验设3次重复，每次重复5个块茎，采用不接菌的块茎为对照。用75%酒精对健康马铃薯块茎进行表面消毒，用0.5cm打孔器在薯块上打5个小孔，取出薯块组织，其中3个小孔放入PSA平板上培养病菌菌丝块，2个小孔放入无菌水，作为对照，再将原薯块组织塞回并用透明胶带封口，置于25ħ暗培养，10d后调查致病率。
致病率=所有块茎发病孔数之和
15ˑ3
ˑ100%
1.2.3病原菌的分子鉴定镰刀菌的基因组DNA提取采用改良的SDS法，具体方法参照韩峰等［13］的方法。镰刀菌rDNA序列的保守区域的扩增引物为：上游引物：5'-GTAAAAGTCGTAACAAG-GTC-3'；下游引物：5'-AAGTTCAGCGGGTATTC-3'。先用r-Taq酶（大连宝生物工程有限公司）进行预试验，
扩增出目的片段后，改用LA Taq酶（大连宝生物工程有限公司）进行扩增。PCR反应条件为95ħ3min；95ħ30s，51.8ħ30s，72ħ45s，30个循环；72ħ5min，4ħ30min。采用凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）对扩增产物进行纯化和回收，对扩增片段进行遗传转化，将重组质粒送到上海联众生物工程有限公司测序。用DNAMAN软件和GeneBank的Blast功能（http：// blast．ncbi．nlm．nih．gov/）进行序列同源性比对和分析，采用MEGA5.20分析软件进行系统发育树构建。
2结果与分析
2.1镰刀菌分离鉴定
饭后吃苹果采用病样分离培养及单孢分离纯化的方法从30个薯块中分离获得了具有明显镰刀菌特征的菌株2株，分别将这两株菌株记为F1和F2。菌株F1在PSA培养基上生长4d的菌落直径为35mm，气生菌丝绒状，浅灰至黄，基物不变（见彩插6图版）；米饭培养基上白至黄；Bilai’s培养基上气生菌丝稀少，白。大型分生孢子较胖，两端较钝，顶孢稍尖，2 5隔，多数5隔；厚垣孢子球形，产孢长筒形单瓶梗。F2菌株在PSA培养基上生长4d的菌落直径为30mm，气生菌丝绒状至棉絮状，草珠红，有土黄菌丝，基物表面苋菜红，基物不变（见彩插6图版）；米饭培养基上枣红至黄；Bilai’s培养基上气生菌丝稀少，白，基物表面淡红。大型分生孢子鳗鱼形，细长，3 8隔，多数5隔；小型分生孢子少，长圆筒形；产孢细胞单瓶梗。依据以上菌株的培养性状和形态特征综合分析，初步鉴定F1为黄镰刀菌（F．culmo-rum），F2为燕麦镰刀菌（F．avenaceum）。
菠菜的作用2.2镰刀菌的致病性分析
将在PSA平板上培养的镰刀菌菌丝块接种于易感马铃薯块茎中，进行致病性分析（见彩插6图
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版）。结果表明，在接种后10d时，接入菌块的有白菌丝长出小孔，形成典型干腐病病斑，而接入无菌水的对照孔没有病变发生（见彩插6图版），这表明两株镰刀菌均有致病性。对两株致病菌的致病率进行了调查，结果表明F1的致病率为41.05%，F2的致病率为72.20%。
2.3两株马铃薯干腐病致病菌的分子鉴定
2.3.1镰刀菌rDNA-ITS的PCR扩增以2株镰刀菌的总DNA为模板，用镰刀菌rDNA的保守区设计引物进行PCR扩增后，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。试验结果表明，在560bp处出现了特异性条带，与预期目的片段的大小吻合，对扩增获得的产物进行产物回收与克隆，对产物进行了克隆和测序。
图1镰刀菌rDNA序列的PCR扩增兴坪渔村
2.3.2rDNA-ITS序列测定与分析采用DNA-MAN软件对重组质粒的测序结果进行分析，结果表明获得的片段同镰刀菌的ITS1和ITS2及5.8S 在内的rDNA-ITS片段相同。采用GeneBank的Blast功能对2株镰刀菌rDNA-ITS的克隆片段进行序列比较和分析，对获得的ITS序列构建的系统发育树，结果如图2所示。
图22株镰刀菌的rDNA-ITS的系统发育树
由系统发育树可以看出，F1和F2的ITS序列分别与黄镰刀菌（F．culmorum）和燕麦镰刀菌（F．avenaceum）聚到了一起，并且相似度达到100%。根据ITS的分子鉴定结果，结合形态学鉴定，确定F1和F2菌株分别为黄镰刀菌（F．cul-morum）和燕麦镰刀菌（F．avenaceum）。
3讨论
不同国家或地区镰刀菌的种类和致病性存在很大差异，我国各地导致马铃薯干腐病的主要病原菌也不尽相同。有研究表明，浙江省马铃薯干腐病的主要致病菌为茄病镰刀菌（F．solani）及其变种、串珠镰刀菌（F．moniliforme Sheld）及其变种和拟丝孢镰刀菌［14］；甘肃省定西地区马铃薯干腐病的主要致病病原菌为硫镰刀菌（F．sulphure-um）［15］、接骨木镰刀菌（F．sambucinum）和腐皮镰刀菌（F．solani）［12，16］；宁夏西吉县马铃薯干腐病镰刀菌主要病原菌为茄病镰刀菌蓝变种（F．solani var．coeruleum）和接骨木镰刀菌［17］；河北省主要的马铃薯干腐病致病菌为茄病镰刀菌和半裸镰刀菌（F．semiteatum）［18］；闵凡祥等［8］对黑龙江省地区的马铃薯干腐病的主
要致病菌进行了常规的分离鉴定，确定了黑龙江省马铃薯干腐病主要病原菌有6个种及变种，致病性由强到弱的顺序为接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌、拟丝孢镰刀菌（F．trichothe-cioides）、茄病镰刀菌霉蓝变种（F．solani var．co-eruleum）、茄镰孢（F．solani）和拟枝孢镰刀菌（F．sporotrichioides）。本研究从黑龙江省哈尔滨市周边的贮藏库中分离纯化了2株镰刀菌，通过常规鉴定确定为燕麦镰刀菌和黄镰刀菌，回接试验表明2病株都可以导致马铃薯出现干腐病的典型症状，致病性试验表明它们均具有较高的致病率，分别为41.05%和72.20%，从而确定两个病株为马铃薯干腐病的致病菌。对2株菌株的DNA-ITS进行克隆和序列分析，表明与GenBank中黄镰刀菌和燕麦镰刀菌菌株的ITS序列具有高度的相似性，比对结果同常规鉴定相一致。首次确定黄镰刀菌为我国马铃薯干腐病的病原菌，并具有较高的致病性。
众所周知，燕麦镰刀菌和黄镰刀菌都可以导致禾本科作物出现镰刀菌病害，如禾本科的赤
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霉病［19－20］，小麦根腐病［21］等，因此，在农业种植中，禾本科植物同马铃薯进行轮作栽培是否可能加重作物的镰刀菌病害，还需要进一步研究。参考文献［1］吕金庆，许剑平，杨金砖．黑龙江省马铃薯生产机械化现状及发展趋势．农机化研究，2009（8）：239－241．［2］刘在东，徐凤
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销售客服
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Stains Associated with Potato Dry Rot
Li Fenglan 1，Jiang Xianfeng 1，Shi Lijuan 1，Han Feng 1，Wei Qi 2，巧虎快乐去上学
Feng Yanzhong 2，Min Fanxiang 2，Guo Mei 2，Li Xuezhan 2
（1College of Life Sciences ，Northeast Agricultural University ，Harbin 150030，Heilongjiang ，China ；
2Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，Heilongjiang ，China ）
Abstract Determining the pathogenic strain of dry rot during potato storage period is of great significance for sci-entific defending and controlling．In this experiment ，we isolated two Fusarium strains with pathogenicity from Har-
bin ，
Heilongjiang province and identified by biological characteristics ，pathogenicity and ITS sequencing analysis．According to the growth rate of strain ，mycelium shape ，colony color ，and substrate surface color etc ，two pathogenic strains were preliminary identified as Fusarium culmorum and Fusarium avenaceum ，and their pathogenicity rate
were 41．05%and 72．20%，
respectively．The rDNA-ITS fragments of two pathogenic strains were completely con-sistent with Fusarium culmorum and Fusarium avenaceum in GeneBank．Combined with the results of morphological identification ，we determined two Fusarium strains for potato dry rot pathogen in Heilongjiang province．Key words
Potato dry rot ；Fusarium Link ex Fr．；Internal transcribed spacer ；Molecule identification
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