紫朱软膏中紫草的质量控制
目的 建立紫朱软膏中紫草的质量控制方法。方法 采用薄层谱法对紫朱软膏中紫草进行定性鉴别。以左旋紫草素含量为评价指标，采用正交试验设计优选左旋紫草素的提取工艺，以紫外可见分光光度法对左旋紫草素进行含量测定。结果 在薄层谱中，主斑点清晰，阴性对照无干扰。左旋紫草素的最佳提取工艺为：提取3次，每次30 min，NaOH体积分数为1%、用量为50 mL。左旋紫草素在0.010 2～0.035 7 mg（r2=0.999 7）范围内与吸收度呈良好的线性关系，平均加样回收率为103.27%，RSD=4.17%。结论 本方法简便可行，可用于紫朱软膏的质量控制和评价。
标签：紫朱软膏；紫草；左旋紫草素；质量控制
紫朱软膏是上海中医药大学附属曙光医院用于糖尿病足的经验方，由紫草、朱砂、冰片、黄芪、龙血竭、阿胶6味药组成，具有清热解毒、祛腐生肌、补气益血功效。紫草作为处方君药，具有抑菌消炎作用，对金黄葡萄球菌、绿脓杆菌等有明显抑制作用，并能促进上皮生长，加速创口愈合[1-2]。紫草含多种活性成分，其中主要是以左旋紫草素为主的羟基萘醌类素，以左旋紫草素为指标性成分对羟基萘醌总素进行质量控制是保证紫朱软膏发挥临床疗效
的必要内容。本研究采用薄层谱法对紫朱软膏中的紫草进行定性鉴别，运用正交试验法优选左旋紫草素的提取工艺，并采用紫外可见分光光度法对紫朱软膏中羟基萘醌总素进行含量测定，建立该制剂的质量标准。
1 仪器与试药
Agilent 8453型紫外分光光度计（美国Agilent公司），Sartorius BSA323S电子天平、Sartorius BT125D电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），BRANSON B550S-MT超声清洗仪（必能信超声上海有限公司），Centrifuge 54300R型冷冻离心机（德国eppendorf公司），旋转蒸发仪（BUCHI公司）。
紫草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号121430-201103），左旋紫草素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110769-200405）；硅藻土、甲醇、石油醚（60～90 ℃）、氢氧化钾、环己烷、乙酸乙酯、甲苯、甲酸、氢氧化钠、硫酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；硅胶HSG板（烟台江友硅胶开发有限公司，批号20130601）；紫朱软膏及其阴性样品均为实验室自制。
2 方法与结果
2.1 紫草薄层鉴别
取紫草对照药材粉末0.5 g，加石油醚（60～90 ℃）20 mL，超声处理20 min，过滤，滤液浓缩至l mL，作为对照药材溶液。称取紫朱软膏20 g，加入硅藻土30 g于研钵中，研匀，在混合粉中加入甲醇100 mL超声提取20 min，提取液10 ℃、4000 r/min离心10 min，上清液过滤，滤液40 ℃旋转蒸干。以石油醚（60～90 ℃）与水各30 mL少量多次交替将旋转蒸干的样品转移至分液漏斗中，静置分层，弃下层水液，上层石油醚液4 ℃、12 000 r/min离心10 min，上清液浓缩至2 mL，作为供试品溶液。另取缺紫草的阴性紫朱软膏20 g，同法制成阴性对照溶液。照薄层谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相同的红斑点；再喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，斑点变为蓝；阴性对照谱中无相应特征斑点。
2.2 左旋紫草素含量测定
2.2.1 对照品贮备液的制备 称取左旋紫草素对照品5.10 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶
解并定容，摇匀，即得浓度为0.102 mg/mL的对照品贮备液。
2.2.2 供试品溶液的制备 称取紫朱软膏5 g，加入硅藻土7.5 g于研钵中，研匀。将混合粉中加入1%NaOH溶液，超声（功率200 W，频率59 kHz）提取3次（50、50、50 mL），合并提取液，于5000 r/min离心20 min，离心后的碱液用0.5 mol/L H2SO4调pH值至酸性，再用氯仿萃取3次（50、50、50 mL），合并氯仿液，40 ℃旋转蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 称取紫朱软膏阴性样品5 g，按供试品溶液制备方法处理，即得。
2.2.4 测定波长的选择 照紫外分光光度法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅤA]，精密吸取左旋紫草素对照品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，并以甲醇为空白在400～800 nm 波长范围内进行扫描。结果左旋紫草素对照品和供试品在（516±1）nm波长处有最大吸收峰，与文献[3]一致，而阴性对照在此波长处无吸收，故对测定无干扰。紫外吸收光谱见图1。
2.2.5 标准曲线的制备 准确吸取左旋紫草素对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.5 mL，分别置
于10 mL容量瓶中，分别加入甲醇至刻度，摇匀，并以甲醇为空白在516 nm波长处测定吸光度。以浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程Y=24.209X-0.000 9，r?=0.999 7。结果表明，左旋紫草素在0.010 2～0.035 7 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.2.6 精密度试验 取对照品贮备液4 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，按标准曲线项下操作，重复测定6次，计算得吸光度RSD=0.29%（n=6），表明仪器精密度良好。2.2.7 重复性试验 分别称取同一紫朱软膏6份，每份5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在516 nm处测定吸光度，代入回归方程计算含量，RSD=1.98%，表明该测定方法的重复性良好。
2.2.8 稳定性试验 取紫朱软膏供试品溶液，分别在0、1、2、3、4、5、6 h测定吸光度，得供试品溶液吸光度RSD=1.36%（n=7），表明供试品溶液在6 h内基本稳定。
2.2.9 加样回收率试验 将紫朱软膏和硅藻土混合均匀，分别称取混合粉末各9份，每份2.5 g，加硅藻土适量，研匀，分别加入80%、100%、120%左旋紫草素对照品，按“2.2.2”项下方法制备，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。按上述方法测定，计算回收率，
结果见表1。
2.2.10 样品含量测定 取3批样品，每批3份，各5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并测定吸光度，代入回归方程计算左旋紫草素含量，结果见表2。
2.3 提取工艺正交试验
2.3.1 正交试验设计 根据预试验中紫朱软膏的提取方法及影响因素，采用正交试验法，选定提取次数、提取时间、NaOH体积分数、NaOH用量作为考察的4个因素，每个因素选择3个水平，选用L9（34）正交表进行试验，因素水平见表3。
2.3.2 正交试验结果与分析 按L9（34）正交表进行试验，并测定516 nm波长处的吸光度，计算左旋紫草素含量，以左旋紫草素含量为评价指标，进行直观分析和方差分析。正交试验安排和结果见表4，方差分析见表5。根据直观分析结果可知，D项R值最小，可作为误差项。以左旋紫草素含量为考察指标，根据极差R值大小可知各因素对提取结果的影响为A>C>B>D，即提取次数>NaOH体积分数>提取时间>NaOH用量。根据方差分析结果可知，因素B（提取时间）和因素D（NaOH用量）对左旋紫草素的提取均无显著影响。综合直观分
析和方差分析结果，同时从生产成本和提取效率的角度考虑，确定最佳提取工艺为A3B1C1D1，即提取3次，每次30 min，NaOH体积分数为1%，NaOH用量为50 mL。
2.3.3 验证试验 称取紫朱软膏5 g各3份，按最佳提取工艺条件提取，进行验证试验，结果测得左旋紫草素含量为42.11%、41.41%、43.40%，RSD=1.95%。验证试验结果与正交试验结果一致，表明优选出的提取工艺稳定、合理、可行。
3 讨论
本试验采用紫外可见分光光度法[4]测定紫朱软膏中紫草羟基萘醌总素（以左旋紫草素计）的含量，方法简便，且软膏中其他组分对测定无干扰，该方法回收率高，精密度和重复性好。
本试验对碱溶酸沉法提取左旋紫草素进行了系统研究，关于左旋紫草素的提取工艺的文献多报道采用碱溶酸沉法，本研究亦采用此方法。左旋紫草素的化学结构为萘醌类化合物，具有酚羟基，呈酸性。碱性溶液提取可使其与油性基质初步分离，加酸酸化后又可使左旋紫草素析出，利用此性质可以将左旋紫草素提取并纯化[5]。
在预试验中对硅藻土用量进行考察，分别加入与紫朱软膏质量比为1∶1、1∶1.5、1∶2的硅藻土，结果表明，紫朱软膏和硅藻土取样量之比为1∶1.5时左旋紫草素含量最高，最终确定硅藻土用量为紫朱软膏 的1.5倍。本试验表明，1%NaOH提取溶液变蓝，0.5 mol/L H2SO4酸化后溶液变红，加氯仿萃取时，溶液逐渐呈无，可根据溶液的颜判断是否提取完全。分别用40、50、60 mL氯仿进行3次萃取后发现，50、60 mL氯仿萃取3次后上层酸液基本无，提示左旋紫草素析出较完全，又因氯仿具有毒性，最终确定氯仿用量为50 mL，萃取次数为3次。
本研究采用正交试验法考察了提取次数、提取时间、NaOH体积分数和NaOH用量对左旋紫草素含量的影响，并优选出了最佳提取工艺。验证试验表明此工艺稳定、合理、可行。
参考文献：
[1] 李治建，周凡，斯拉甫·艾白，等.紫草药理作用研究进展[J].中国中医药信息杂志，2010，17（11）：110-112.
[2] 马莹.药用紫草的研究进展[J].黑龙江医药，2013，26（6）：131-132.
buchi[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：320.
[4] 范芳芳，刘泽蒲，陈文.紫外分光光度法测定O/W型紫草脂肪乳剂中总萘醌的含量[J].中国药房，2005，16（20）：1577-1578.
[5] 张格，张俊，程璐.紫草解毒软膏质量标准研究[J].医药导报，2012， 31（4）：486-488.