doi：10．11751/ISSN．1002－1280．2019．09．10
张崇威1，邱瑾丽2*，李红娇2
（1.河南省兽药饲料监察所，郑州450008；2.郑州福源动物药业有限公司，郑州450001）
［收稿日期］2019－06－17［文献标识码］A［文章编号］1002－1280（2019）09－0065－07［中图分类号］S859.84
［摘要］研究临床使用常规剂量及养殖环节加大盐酸土霉素可溶性粉剂量后其在鸡蛋中的残留消除规律。对产蛋期蛋鸡分别给予500mg/L和667mg/L50%盐酸土霉素可溶性粉，集中饮水给药，每日1次，连续5d。分别采集停药后1 12d的鸡蛋样品，采用UPLC－MS/MS测定鸡蛋中土霉素的残留量。按上述方法给药后，低、高剂量组分别在停药第1天和停药第2天达到土霉素残留量最高。低、高剂量组的最高残留量分别为142.72、82.84μg/kg，均低于国家规定的最高残留限量（200μg/kg），不会造成土霉素残留超标。本试验通过研究土霉素可溶性粉在鸡蛋中的残留情况，确定弃蛋期前后土霉素残留量，以期为蛋鸡产蛋期安全用药，保障食品安全提供科学依据。
［关键词］盐酸土霉素；残留消除；鸡蛋
Study on the Degradation of Oxytetracycline in Chicken Eggs
ZHANG Chong－wei1，QIU Jin－li2*，LI Hong－jiao2
（1.Henan Institute of Veterinary Drugs and Feed Surveillance，Zhengzhou450008，China；
2.Zhengzhou Fuyuan Animal Pharmaceutical Co.，LTD，Zhengzhou450001，China）
Abstract：This study aimed to study the degradation of the residues in eggs after clinical use of oxytetracycline hydrochloride soluble powder.Two groups of layers took50%oxytetracycline hydrochloride soluble powder of500 mg/L and667mg/L concentrations respectively at water－drinking times for5days consecutively，one time per day.Eggs were collected on day1through day12after the withdrawal of the drug，and the residues were tested by UPLC－MS/MS method.The study showed that the peak level of drug residual for the lower dose group and higher dose group were reached on day1and day2after drug withdrawal；and the maximum amount of residue in the lower lose group and higher dose group were142.72μg/kg and82.84μg/kg respectively，both of them were lower than the maximum residue limit（200μg/kg）in the state provisions，the level of the oxytetracycline residue did not exceed the standard.By studying the residue of oxytetracycline hydrochloride soluble powder in eggs，this experiment determined the residual amount of oxytetracycline before and after egg abando
ning period so as to provide scientific basis for the safe use of drugs in laying period and ensuring food safety.
作者简介：张崇威，硕士，兽医师，从事兽药残留检测研究。
通读作者：邱瑾丽。E－mail：qjlqlhwqq@163
Key words：oxytetracycline hydrochloride；degradation of residue；eggs
盐酸土霉素可溶性粉为四环素类广谱抗菌药物制剂，能迅速抑制细菌的生长繁殖。临床上常用于猪、鸡敏感大肠埃希菌、沙门氏菌、巴氏杆菌及支原体引起的感染性疾病。盐酸土霉素可溶性粉可用于产蛋期，产蛋率下降或停止产蛋，以及因输卵管炎造成的蛋壳上带有血迹、产畸形蛋和软壳蛋、输卵管排出黄白脓样分泌物等［1］。根据在养殖环节的调查，养殖场常以高于常规剂量给药，给药剂量为667mg/L50%盐酸土霉素可溶性粉，饮水给药，高于国家规定的500mg/L给药剂量。人体长期摄入含少量抗生素的食品后，会造成药物的蓄积，产生毒性作用，严重的会出现致癌、致畸、致突变等，因此，对食品安全带来极大的潜在危害［2］，我国农业农村部规定了土霉素在鸡蛋中的最高残留限量标准为200μg/kg，弃蛋期2d。目前，我国关于鸡蛋中土霉素的研究主要针对残留检测方法的研究，包括超高效液相谱－串联质谱法［3］、高效液相谱法［4］、固相萃取－高效液相谱法［5］、毛细管电泳－电化学检测法［6］等，尚未见关于盐酸土霉素可溶性粉按国家规定剂量和增加剂量使用后在鸡
蛋中残留消除规律的研究，本试验通过研究盐酸土霉素可溶性粉在鸡蛋中的残留情况，确定弃蛋期前后土霉素残留量，以期为蛋鸡产蛋期安全用药，保障食品安全提供科学依据。
1材料与方法
1.1主要试剂土霉素对照品，批号：130305，中国食品药品检定研究院；盐酸土霉素可溶性粉，规格：50%，生产批号：201708003，郑州福源动物药业有限公司苏可乐（批准文号：兽药字160256691）；甲醇，乙腈为谱纯；乙二胺四乙酸二钠为分析纯，超纯水，所需溶液配制见GB/T21317［7］。
1.2主要仪器Acquity UPLC－XEVO TQ－S质谱联用仪（美国Waters公司）；3K－30台式高速冷冻离心机（Sigma公司）；Ｒ215Professional旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；IKAMS3.Basic圆周振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；ALC－2100.2电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；VX－Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；TTL－DC Ⅱ氮气吹干仪（北京同泰联科技发展有限公司）；TD系列固相萃取柱，TD－TPS－00603（天津市兴达科技有限公司）。
1.3试验动物及分组试验选用三棚蛋鸡，品种为京红，362日龄，购自山西省阳城县浩博养殖有限公司，常规饲养，进行常规免疫程序，试验前不使用任何药物。三棚蛋鸡随机分为空白对照组（15000只），常规剂量组（14000只），加大剂量组（15000只）。饲喂不添加任何抗菌药物的全价饲料，自由采食饮水。试验前后各组蛋鸡饲养条件相同。
1.4给药和样品采集常规剂量组以500mg/L，加大剂量组667mg/L集中饮水给药5d，空白对照组不给药。根据农业部文件农医发［2018］2号中畜禽产品兽药残留抽样要点［8］，在停药后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12d，每个时间点分别从不同剂量组的鸡棚前中后位置的产蛋架随机采集鸡蛋，每个时间点10个样本，每个样本10枚鸡蛋。样本标记，冰箱4ħ保存，待测。
1.5谱条件谱柱：Waters Acquity UPLC TM BEH C18（1.7μm，
2.1ˑ100mm）；柱温30ħ；流动相A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；进样量5μL；梯度洗脱程序见表1。
表1谱梯度洗脱程序
Tab1Procedure of gradient elution
时间
time/min
流速Flow rate
/（mL·min－1）
A/%B/%
曲线类型
Curve 1Initial0.30010.090.0/
2 4.000.30040.060.06
3 5.000.30010.090.01
1为即时变化，6为线性变化
1.6质谱条件电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测MＲM；离子源温度150ħ；脱溶剂气容量800L/h；锥孔电压25V；锥孔气流速150L/h；毛细
管电压3.3kV；定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。
表2定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞能量
Tab2Qualitative and quantitative ion pair and the corresponding cone volt and collision enerey
药物Compound 定性离子对（m/z）
Qualitative
定量离子对（m/z）
Quantitative ion pair
锥孔电压/V
Cone volt
碰撞能量/eV
Collision enerey
土霉素461.2＞426.1
461.2＞337.0
461.2＞426.1
38
38
18
26
1.7样品前处理用匀浆机把鸡蛋制成匀浆，称取匀质样品（2ʃ0.02）g，置50mL离心管中，加入16mL缓冲液，漩涡震荡20min，14000r/min低温离心5min，静置，取上清液8mL进行样品净化。HLB固相萃取柱用3mL甲醇、3mL水活化，取上述鸡蛋待净化的8mL上清液注入萃取柱中，分别依次用3mL水、3mL5%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液后，用3mL甲醇洗脱，洗脱液50ħ水浴中氮气仪吹干，残渣用1mL30%甲醇溶液复溶，充分混匀，残渣溶液过0.22μm针头式过滤器后，滤液供液相谱－串联质谱法检测，若残留量超出曲线范围，以相应空白基质稀释至曲线范围。
1.8标准曲线分别精密吸取100μg/L的土霉素标准中间液0.02、0.05、0.08、0.10、0.20mL于1.7项中氮气吹干后所得残渣，加30%甲醇溶液0.98、0.95、0.92、0.90、0.80mL，混匀，制成2、5、8、10、20μg/kg的系列基质标准溶液，依次上机，以土霉素的质量浓度为横坐标，定量离子的谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.9检测限和定量限取匀浆后空白鸡蛋样品2g，添加适量的土霉素标准溶液，按照1.7项进行处理，经液相谱串联质谱测定，按信号（S）与噪音（N）比值计算，S/N＞3为检测限，S/N＞10为定量限值。
1.10精密度和准确度分别取匀浆后空白鸡蛋样品2g，添加4、200、400μg/kg水平的土霉素进行回收率试验（按照1.7项进行处理），每个添加水平6个平行，连做3次，并计算日内相对标准偏差及日间相对标准偏差。2结果与分析
2.1线性关系土霉素在2 20μg/kg浓度范围内呈现良好的线性关系，其曲线方程为：y= 17489.07447X－2109.07021，相关系数r为0.99968，如图1所示。标准溶液图谱如图2
。
图1土霉素标准曲线
Fig1Standard curve of
oxytetracycline
图2鸡蛋基质中10μg/kg土霉素标准液的特征谱图Fig2chromatogram of10μg/kg oxytetracycline
standard solution in egg matrix
2.2检测限和定量限根据特征质量谱峰的信噪比S/N＞3为检测限，S/N＞10为定量下限，得鸡蛋
中土霉素的检测限为2μg/kg，定量限为4μg/kg。
2.3准确度和精密度土霉素在4、200、400μg/kg 3个添加水平上，每个添加水平做6平行，其平均回收率、日内相对标准偏差及日间相对标准偏差见表3。土霉素的回收率在79.1% 9
3.6%之间，日内相对标准偏差及日间相对标准偏差均小于10%。图3为空白鸡蛋的土霉素特征离子质量谱图，图4为空白鸡蛋中添加10μg/kg的土霉素特征离子质量谱图。
表3土霉素回收率及相对标准偏差实验（n=6）
Tab3Test of recovery rate and relative standard deviation（ＲSD）of Oxytetracycline（n=6）
药物名称Name 添加量/（μg·kg－1）
Amount of addition
平均回收率/%
Average recovery
日内相对标准偏差/%
Intra－dayＲSD（%）
日间相对标准偏差/%
Inter－dayＲSD（%）
土霉素Oxytetracycline
480.583.986.4 6.7 4.1 3.48.1 20092.589.590.4 2.1 1.9 3.7 5.5 40090.191.789.8 2.2 1.5 2.7 5.
3
图3空白鸡蛋的土霉素特征离子质量谱图
Fig3The characteristicion quality chromatogram
of oxytetracycline in blank
eggs
图4空白鸡蛋中添加10μg/kg土霉素的特征谱图
Fig4Chromatogram of oxytetracycline
（10μg/kg）in blank eggs
2.4鸡蛋中土霉素的残留消除按照前处理方法
对所采集的鸡蛋中土霉素残留进行检测，外标法定
量。不同采样点土霉素残留量见表4，残留消除曲
线如图5。
表4高低剂量组鸡蛋中的土霉素残留量
（XʃS，n=10）（μg/kg）
Tab4Oxytetracycline residues in Eggs in
high and low dose groups（XʃS，n=10）（μg/kg）
停药后时间/d
Time after withdrawal
残留量/residues/（μg·kg－1）
常规剂量组
（500mg/L）
normal dose
加大剂量组
（667mg/L）
High dose
1142.72ʃ11.60274.71ʃ6.290
271.39ʃ9.78682.84ʃ20.297
357.93ʃ10.46259.47ʃ9.452
427.91ʃ8.44960.17ʃ10.201
526.83ʃ4.69541.86ʃ5.047
619.34ʃ3.01420.48ʃ1.248buchi
725.83ʃ2.04330.86ʃ5.688
815.64ʃ2.59824.75ʃ7.751
912.11ʃ2.76615.33ʃ3.199
1022.54ʃ10.52320.41ʃ1.364
1110.00ʃ1.85710.54ʃ2.902
12
8.79ʃ1.223
17.00ʃ1.
892
图5
鸡蛋中土霉素残留消除曲线
Fig 5
Depletion curve of oxytetracycline residue in egg
空白对照组试验期间与各试验组饲养条件和采样时间点相同，空白对照组样品在各取样时间点均未检测出土霉素残留，表明实验动物在试验期间未受到其他来源药物的影响，实验动物在试验期间土霉素残留均来源于目的性给药。表4结果显示，蛋鸡产蛋期分别按500mg /L 和667mg /L 剂量，连续5d ，每天1次，集中饮水给药50%盐酸土霉素可溶性粉。低剂量组在停药第1天，土霉素残留量最高，达到142.72μg /kg ，高剂量组残留量为74．71μg /kg ，高剂量组在停药第2天残留量最高，82.84μg /kg ，与我国规定的弃蛋期2d 符合。高、低剂量组在停药后的1 12d ，鸡蛋中的土霉素残留量均低于国家农业部235公告中规定的最高残留限量（200μg /kg ）。以上数据经方差分析，P ＞0.05，两组差异不显著。在临床病情严重时，按标签最大剂量的1.33倍给药后，不会造成土霉素在鸡蛋中残留量超标。3讨论
3.1
药物剂量的选择
盐酸土霉素可溶性粉是我
国极少数可用于蛋鸡的广谱抗生素，因此，在临床中常用于蛋鸡的输卵管炎。50%盐酸土霉素可溶性粉根据《兽药质量标准》（2017年版）化学药品卷
［9］
中用法用量为，
以本品计每1L 水鸡300 500mg ，连用3 5d 。因此，本试验选用标签中最大使用浓度500mg /L 作为常规剂量组，由于临床使用过程中存在加大药物使用剂量现象，经在养殖环节中现场调查，加大剂量一般为667mg /L （每150kg 水100g 本品），因此，选用667mg /L 作为加大剂量组，经集中饮水给药途径，连用5d ，研究土霉素在鸡蛋中的残留水平。3.2
药物在鸡蛋中的残留情况
试验选用的两个
剂量是盐酸土霉素可溶性粉在临床输卵管炎常用剂量，在大养殖环境中，蛋鸡通过集中饮水给药，土霉素残留情况与试验室研究存在一定差异。低剂量组与高剂量组在停药3d 残留量比停药1d 分别
下降了59.4%和20.4%，并且残留量均较低，说明土霉素在蛋鸡体内的代谢速率相对较快，我国规定鸡蛋中土霉素的最高残留限量（MＲL ）
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