HPLC测定真菌及其制品中麦角甾醇含量
作者：王晓琴 黄秀丽 陈月景 罗旋 胡嘉珊 翁嘉
来源：《农学学报》2021年第04期
        摘要：本研究旨在出真菌及其制品的特征指标，用于其质量评价、掺伪鉴别等。建立了真菌及其制品中麦角甾醇含量测定的高效液相谱法（HPLC），并利用建立的HPLC法对冬虫夏草、破壁灵芝孢子粉等真菌及其制品以及螺旋藻、大豆油等6种植物油样品进行麦角甾醇含量的测定。结果显示，麦角甾醇在5～160μg/mL范围内具有较好的线性，线性相关系数大于0.999，检出限为0.1μg/mL，平均回收率为86.32%～105.24%。螺旋藻以及大豆油等6种植物油中均未检出麦角甾醇，真菌类及其制品中均含有麦角甾醇，麦角甾醇具有专属性。
该方法操作简便、灵敏，且具有较好的重复性和稳定性，可应用于真菌及其制品中麦角甾醇含量的定量分析。
        关键词：真菌及其制品；麦角甾醇；专属性，高效液相谱法（HPLC）
        中图分类号：S567.3文献标志码：A论文编号：cjas20191000244
        Determination of Ergosterol in Fungi and Its Products by HPLC
        Wang Xiaoqin， Huang Xiuli， Chen Yuejing， Luo Xuan， Hu Jiashan， Weng Jia
        （Huizhou Institute for Food and Drug Control， Huizhou 516000， Guangdong， China）
        Abstract： The aim is to find out the characteristic indexes of fungi and its products for quality evaluation and adulteration identification. The HPLC method was established for determining ergosterol in fungi and its products. With the established HPLC method， the contents of ergosterol were determined in fungi and its products （Cordyceps sinensis and
Ganoderma lucidum spores powder）， spirulina and six kinds of plant oil， such as soybean oil. The results showed that there was a good linearity in the range of 5-160μg/mL of ergosterol， the correlation coefficient was more than 0.999， the detection limit was 0.1μg/mL， and the average recovery was from 86.32% to 105.24%. Ergosterol was not determined in spirulina and six kinds of plant oil （such as soybean oil）， while it was detected in fungi and its products. Ergosterol had specificity in fungi and its products. This study suggests that the method is simple and sensitive， and has good repeatability and stability， thus it can be adopted to quantitatively analyze ergosterol in fungi and its products.
        Keywords： Fungi and Its Products； Ergostero； Specificity； High Performance Liquid Chromatography （HPLC）
        0引言
        目前，真菌在保健方面的作用漸渐被大家所认识，如冬虫夏草、灵芝孢子系列等产品已经广为大家所接受，另外在筛选新药及寻抗癌药物方面，食药用真菌也已作为重要的研究
对象[1-3]。甾体类成分对真菌有着重要的生理功能，同时还具有多种生物学活性，因此研究真菌甾体类成分具有十分重要的理论意义和应用前景[4-6]。
        麦角甾醇是大型真菌中普遍存在的甾体类化合物，也是真菌类的特征甾醇，主要存在于绝大多数的真菌细胞膜中[7]，维系着真菌细胞的正常代谢[8]，可以增强人体抵抗疾病的能力，是重要的脂溶性维生素D2源[9-11]，具有明显的抑菌、抗肿瘤功效[12-13]，其含量与真菌生物量存在相关性[14]，可以通过检测麦角甾醇含量来测量真菌的生物量。
        目前，真菌中麦角甾醇的含量研究已经有了一些成果，灵芝、灵芝孢子油，香菇，喇叭菌、美味牛肝菌、冬虫夏草等已有研究，不同真菌中麦角甾醇的提取方法主要有皂化回流[16]、超临界提取[17]、闪式提取[18]和超声辅助提取[19]等，对麦角甾醇的定性与定量分析研究主要报道的方法有UV法[20]、毛细管电泳法[21]、高效液相谱法[22- 23]、液相谱-质谱法[8，24]和气相谱-质谱法[25-26]等，与其他方法相比，HPLC分析不需要进行衍生化，操作简单，结果可靠。关于真菌中多糖的研究开发较多，但是麦角甾醇作为食药用真菌所含有的一种重要资源还没有得到广泛开发利用，现有研究大多集中于单一种类真菌中麦角甾醇的研究，系统研究较少，同时也缺乏菌类麦角甾醇检测的国家标准，导致把关不严，市
场上销售的真菌质量参差不齐，尤其掺假灵芝孢子油的乱象不断。因麦角甾醇在大部分植物中不含有或含量很小，其良好的特异性和稳定性使其可作为真菌的特征指标，建立麦角甾醇含量测定的方法，对于推动其在食药用真菌及其产品质量控制与评价中的应用具有重要作用。
        本研究旨在提取真菌及其制品中的麦角甾醇，建立高效液相谱（HPLC）测定方法，为食药用真菌的进一步研究和开发利用提供依据，同时为食药用真菌质量评价提供方法参考。
        1材料与方法
        1.1仪器
        高效液相谱仪（岛津LC-20A），旋转蒸发仪
        （BUCHI Rotavaper R-210）。buchi
        1.2材料与试剂
        麦角甾醇标准品为HPLC级，纯度≥98%，购于中检院。冬虫夏草，蛹虫草，赤灵芝子实体，紫芝子实体，灵芝孢子粉、猪苓、猴头菇、香菇、桦褐、黑木耳、茯苓、灵芝孢子油、螺旋藻购买于专卖店、药店或官方旗舰店，菜籽油、大豆油、玉米油、葵花籽油、花生油和橄榄油购于当地大型购物超市。谱分析用流动相甲醇为谱纯，其余试剂为分析纯。试验在惠州市食品药品检验所食品室，于2018年10月—2019年5月进行。
        1.3实验方法
        1.3.1谱条件谱柱为ODS-2 HYPERSIL（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇；流速1 mL/min；检测波长282 nm；柱温37℃；进样量10μL；外标法定量。
        1.3.2对照品溶液的制备准确称取20 mg（精确至 0.0001 g）麦角甾醇于20 mL棕容量瓶中，用甲醇-溶液（1：1，V/V）定容至刻度，摇匀，即得（浓度为1 mg/mL）。
        1.3.3供试品溶液的制备称取约0.5 g粉碎后样品（精确至0.001 g）于100 mL密封玻璃容器中，加入40 mL 50 g/L的氢氧化钠-甲醇溶液，混匀后于80℃水浴皂化1 h，皂化后立即用冷水冷却至室温。
        将皂化液转移到250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振荡提取，将下层溶液转移至另一250 mL的分液漏斗中，重复提取1次，合并醚层。将醚层并入蒸发瓶内，于50℃水浴中减压蒸馏浓缩，待瓶中醚液近干时，取下蒸发瓶。用甲醇-溶液（1：1，V/V）将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10 mL棕容量瓶中，定容至刻度。过0.45μm有机系滤膜，待上机测定。
        2结果与分析
        2.1提取条件的选择
        对2种水解液（50 g/L NaOH-甲醇溶液；50 g/L KOH-乙醇溶液）、水解液体积（20、30、40 mL）、皂化温度（40、60、70、80、90℃）、皂化时间（30、45、60、75、120 min）等因素进行了考察。
        结果发现2种水解液中，相同提取条件下以50 g/L氢氧化钠-甲醇溶液提取效果较佳。水解液体积（20、30、40 mL）对麦角甾醇提取率影响不大，差异不显著，考虑到真菌类样品菌丝体较轻，所占体积较大，为了保证样品能皂化完全同时又不造成浪费，选用水解液体积
为40 mL。考察了不同皂化温度对麦角甾醇提取率的影响，发现80℃和90℃下皂化效果均较佳，从安全及能耗等方面考虑，确定皂化温度为80℃。对80℃下皂化时间进行了考察，发现随着皂化时间的延长，提取率不断升高，当皂化时间为60 min时，麦角甾醇提取率最高，皂化时间为120 min时，提取率反而有所下降，为此确定皂化时间为60 min。
        2.2谱条件的选择
        2.2.1检测波长的选择利用紫外分光光度计对麦角甾醇标准品进行扫描，波长范围为190～700 nm，结果麦角甾醇在282 nm处具有最大吸收峰，为此确定麦角甾醇检测波长为282 nm。
        2.2.2流动相的选择检测麦角甾醇常用流动相有甲醇、甲醇-水等洗脱系统。本实验考察了不同比例甲醇-水作为流动相的差别，结果显示，在不同配比条件下随着水比例的增加，麦角留醇峰形变低、变宽、保留时间变长，在100%甲醇的比例下，不但出峰时间提前，其响应值也相对提高，麦角留醇峰形窄、对称，可以与样品中其他成分分开，而且实验操作简单、方便、快捷。故本研究选用100%甲醇作为流动相，麦角甾醇保留时间在14.421 min，柱效和峰形良好。