地表水中六种雌激素化合物分析规范
注：本方法适用于地表水、饮用水和污水中六种雌激素化合物的测定
1.目标化合物
天然动物性雌激素雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和作为药物使用的人工合成的雌激素类药物己烯雌酚(DES)、乙炔基雌二醇(EE2)、戊酸雌二醇(EV)、乙烷雌酚、炔诺酮等在极低的环境浓度(ng/L)下就可能对生物体造成危害。引起了世界各国的广泛关注。但由于研究相对滞后，美国国家环保局、世界卫生组织和世界动物基金会均未对该类物质作出明确的规定。雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、己烯雌酚(DES)、乙炔基雌二醇(EE2)、戊酸雌二醇(EV)是比较常见和典型的内分泌干扰物质，本研究以上面六种雌激素为目标化合物。
1.1.试剂
甲醇（Methanol），HPLC级（美国Fisher Scientific公司）；丙酮：谱纯（TEDIA）；
buchi正己烷（n-Hexane），农残级（美国Fisher Scientific公司）；叔丁基甲醚：J.T. Baker, US；
硅胶（60－200目），超纯（美国ACROS ORGANICS）；中性氧化铝（50－200目），（美国ACROS ORGANICS）；无水硫酸钠，优级纯，经450℃焙烧12 h后置于密封广口瓶中保存备用；
雌激素分析用标准物质：衍生化试剂：N,O－双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺，简称BSTFA（FLUKA），TMSI；EE(乙炔基雌二醇)，ALDRICH；E1(雌酮)，SIGMA；E2(雌二醇)MERCK；E3(雌三醇)，FLUKA；EV(戊酸雌二醇)SIGMA；DES(己烯雌酚)FLUKA。
剪刀、滤纸、镊子及药匙（硅胶柱净化所用）：以二氯甲烷超声清洗15min两次、正己烷超声清洗15min一次；首先硅胶和氧化铝先使用二氯甲烷抽提72小时，然后硅胶在180±2℃、氧化铝在250±2℃分别活化12 h（activate）；待冷却至室温时，称重后装入大口锥形瓶（250或500mL），加入其重量3％的蒸馏水去活性（deactivate），添加过程中应用滴管逐滴加入，边加边用力振摇以防止结块，并超声振荡30 min；放置过夜，平衡后加入正己烷浸没其表面备用（一般也需放置过夜）；玻璃滤膜，经450℃焙烧4 h，准确称重,放入干燥器中放置备用。
1.2.仪器
超声波清洗仪(KQ－250D型数控超声波清洗器)
恒温水浴锅（中国科工卫仪器仪表公司）
旋转旋蒸仪(Buchi, Vac® 500/rotavapor R-200/Heating bath B-490,Germany)
氮吹仪(数控氮吹仪，KL512/5093,康林,北京)
气相谱质谱连用仪：GC6890-MSD5973(Agilent Technologies，美国)，使用G1701 DAMSD ChemStation分析处理数据；
毛细谱柱：HP-5石英毛细管谱柱：30 m 0.32 mm ID 0.25 m液膜厚
蠕动泵，玻璃滤膜支架，直径50mm ×孔径1.0μm玻璃滤膜(Millpore Co.,北京联星事业公司代理)
SPE固相萃取小柱(HLB，Waters Co.)
固相萃取真空装置(12小柱，Supco Co. 配有12根聚四氟乙烯导管)
真空泵(Supco Co.）
100级超净工作室；
高纯氮气
2.玻璃仪器及其它用品
常规玻仪及其他用品：100ml、50ml、10ml量筒；200ml、100ml、50ml烧杯；500ml、50ml试剂瓶；胶头滴管、玻璃漏斗、玻璃棒；100ml、50ml三角瓶（带塞）；药匙、5 ml移液管、微量进样器、乳胶手套、布手套等。
10 L, 5L 棕玻璃采样瓶若干。
所用玻璃仪器均以10％的稀硝酸浸泡过夜，再以重铬酸钾洗液润洗浸泡20min以上，分别用自来水、蒸馏水冲洗干净，在烘箱中110℃烘干；
GC自动进样的样品瓶、标准样品瓶、层析柱必须用铬酸洗液浸泡一段时间后再认真冲洗干净烘干，并在400˚C高温烘烤2小时以上。
3.样品采集与保存
使用棕玻璃瓶采集水样(对于不同的水样，采集体积不同，对于地表水采集4L;对于污水采集2L;对于自来水采集10L，对于非地表水采样要求大体积样品都采用24小时连续采样技术，间隔1小时采样1次，采完后混匀)，注明采样时间、采样地点、样品编号、样品名称、采样人姓名等；加入0.5％的甲醇(抑止微生物活性，保持目标化合物溶解状态)；对于自来水加入40 mg/L的硫酸钠除氯；同时可以根据需要使用6N的HCl调整水样的pH到3.0。样品运回实验室后保存于冰箱（4℃）中，密封保存(注意避光)，在存放样品时，应尽量注意存放在没有有机气体干扰的区域，以免交叉污染。所采样品在7天内前处理完毕，一个月内分析完毕。
4.样品制备
4.1.过滤与颗粒物样品的收集
使用Millpore整套过滤装置和玻璃滤膜过滤水样，首先将过滤后的滤膜和颗粒物收集，冷冻
干燥，用铝箔收集放入冰箱中备用；其次将过滤后的水样，准确量取2L，加入回收率指示物氘代雌激素E2d3 (加入浓度根据当地污染程度确定，原则是与样品中目标污染物浓度相接近)，充分摇匀备用。
4.2.富集
采用500mg的HLB固相萃取柱(SPE)用于水样的富集。先安装好真空抽滤装置及固相萃取装置，SPE柱在使用前依次用叔丁基甲醚（二氯甲烷）、甲醇、蒸馏水各5mL清洗,每次加液后保持5min，开真空泵抽取液体，应控制流速，使液体从萃取柱呈滴状滴出(在清洗时，放出试剂在柱填料的表面应保持一个液面，防止流干，蒸馏水的清洗方式同样)。处理完后小柱处于活化状态。调节好真空度(真空度应小于20毫米汞柱)，使水样过柱的流速恒定在10mL/min。富集完毕后，将水抽干，用氮气吹干(或使用高速离心机甩干)。富集完后如不能马上洗脱，应将小柱用铝箔包好，放至冰箱（4℃）保存，作好编号。
4.3.清洗
富集完毕后，分别用5ml甲醇/水（4:6, v/v），5ml纯水，5ml甲醇/氨水/水（10:2:88），5ml纯水清洗，然后抽干。
4.4.洗脱
吹干后的小柱，放在真空装置上，下面用K-D浓缩器承接，以10mL甲丁醚/甲醇（9：1，V/V）洗脱，混合液为洗脱剂分两次淋洗。注意HLB固相萃取柱填料上界面始终不能接触空气。用微弱氮气流吹到0.5mL左右，留待净化。
4.5.样品净化与浓缩：
在干净的（内径为10mm）内采用正己烷湿法装柱，先装3cm硅胶，再装3cm氧化铝。注意在装柱过程中，要不断加入正己烷以免氧化铝粘附在管壁上。保持正己烷以适当的流速不断的流出，并保证正己烷液面始终高于柱填料界面，同时不断用洗耳球轻轻敲打管壁，使柱填装紧密，不断层。然后调节正己烷液面正好处于氧化铝层面之上，将0.5mL待净化富集样品从K-D浓缩器转移到净化柱中，用2mL丙酮/甲醇（5：5，V/V）混合液分三次清洗盛样品的K-D浓缩器，转移到净化柱中，用10ml丙酮/甲醇（5：5，V/V）洗脱，然后以60滴/min左右的流速流出，直到液面刚好处于氧化铝层面之上。洗脱液用K-D浓缩器收集，用微弱氮气流吹干，加入80ul衍生试剂，用正己烷定容到0.5mL，水浴60℃加热30min，转移至样品瓶中，备GC/MS分析。
5.分析测定方法
5.1.谱条件
所有样品均在气相谱-质谱联用仪GC6890-5973MSD上分析。HP-5MS石英毛细管谱柱（60m×0.25mm×0.25μm），He为载气，流速恒定为1mL/min，线速度26cm/sec；进样口280℃，MSD 280℃，电子能量：70eV；SIM模式下程序升温：100℃起以10℃/min速度升到300℃，保持3min；无分流进样1μL；溶剂延迟：6min。
5.2.定性与定量
通过检索NIST质谱谱库和谱峰保留时间进行定性分析，并采用外标峰面积法、6点校正曲线定量。
6.质量保证与控制(QA/QC)体系
6.1.质量保证/质量控制目标：
6.1.1.QA: Quality Assurance, 准确性、精密性、可比性
6.1.2.QC: Quality Control, 较高的可靠性
6.1.3.MDL:在99%以上的置信度，某物质可被可检出和报告的最低浓度。应至少分析3个以上的含预计方法限浓度3-5倍的目标化合物的搀混样品获得MDL
6.2.质量保证/质量控制体系要求：
6.2.1.质量控制样品：空白样品，空白加标样，基质加标样，重复样(每20个测试样品同时完成一组质量控制样品的测试)。
6.2.2.目标化合物回收率：通过空白加标样品的测定，得到目标化合物的回收率。
6.2.3.仪器检测限(IDL)：测定空白样品(n=6)的5倍最小噪音(noise), 仪器检测限(IDL)等于3.36乘以5倍最小噪音的标准偏差(n=6),验证仪器状态。
6.2.4.方法检测限(MDL):基质加标样(n=6)测定，根据U.S.EPA方法检测限测定公式计算出本实验流程(方法)对各种目标化合物的检测限，判断本实验方法对实际样品中目标化合物检测数据的可信度。
6.2.5.校正曲线：内标(I.S)定量法. 多点校正(n=6),要求RRF的RSD%<25%。
6.2.6.工作曲线：用新配制的标样，测定值与已知值(校正曲线)<20%.
7.备注
7.1.在整个样品制备过程中避免样品的污染；
7.2.第一次进行测定人员必须经过有经验人员培训之后方可独自进行操作；
7.3.实验过程中出现问题请及时与周益奇联系；
7.4.发现本操作方法体系有问题者请及时补充。
图 1 净化柱图例
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