时华曜;范崇旭;代先东;刘尚义;曹瑛
【摘 要】Dmab was a protecting group of carboxyl with the advantages of rapid and chemoselective removal in solid phase peptide synthesis(SPPS), but the efficiency of deprotection of Dmab was not stable sometimes. Therefore, based on the Fmoc/tBu/Dmab orthogonal protection strategy, four peptide resins were synthesized by SPPS, and the deprotection reaction condition of Dmab in SPPS was studied. The results showed that the α-ODmab of Glu and Asp could be removed quickly and complete-ly on the peptide resin, but the intermediate product of 4-aminobenzyl ester peptide could be detected after the deprotective reaction of β-ODmab of Asp and γ-ODmab of Glu. The efficiency of deprotection of Dmab could be deduced as α-ODmab ＞β-ODmab ＞γ-ODmab. In conclusion, the Dmab protecting group held promise in SPPS, especially in the synthesis of head-to-tail cyclic peptides, but was not enough ideal in the synthesis of side-chain cyclic peptides or modified peptides.%在固相多肽合成中,Dmab作为羧基保护基具有脱保护条件温和、步骤简便、选择性
高的特点,但有时脱保护效率并不稳定. 为此,基于Fmoc/tBu/Dmab三维正交保护策略,利用固相多肽合成技术设计并合成了4个肽树脂,对固相多肽合成中Glu和Asp主链和侧链羧基的Dmab保护基脱除规律进行了研究. 结果显示,树脂上α-ODmab的脱保护快速、完全,β-ODmab和γ-ODmab脱保护反应较慢,可以检测到相应的中间产物(4-氨基苄酯肽),推测脱保护效率由快到慢依次为 α-ODmab ＞ β-ODmab ＞ γ-ODmab. 该结果表明Dmab作为α-COOH保护基具有较高的应用价值,但用于β-COOH和γ-COOH保护时,其脱保护条件尚不成熟.
【期刊名称】《化学研究》
【年(卷),期】2018(029)003
【总页数】7页(P257-263)
【关键词】Dmab保护基;脱保护;固相多肽合成
【作 者】时华曜;范崇旭;代先东;刘尚义;曹瑛
【作者单位】军事科学院 防化研究院,北京102205;军事科学院 防化研究院,北京102205;军事
科学院 防化研究院,北京102205;军事科学院 防化研究院,北京102205;军事科学院 防化研究院,北京102205
【正文语种】中 文
【中图分类】O621.3
Dmab(4-{N-[1-(4,4-Dimethy-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl] amino} benzyl)是近年来用于固相多肽合成的新型保护基团[1-4](图1)，用作保护氨基酸的羧基，在20%或三氟乙酸(TFA)中稳定存在[5]. Dmab的脱除分两步进行，首先，ivDde(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl)可以通过2%水合肼溶液选择性地脱去；然后，剩余的氨基苄基(4-aminobenzyl)经1,6-电子迁移自发消去，从而得到相应的羧酸[6-7](图2).
图1 Dmab-OH结构式Fig.1 Structure of Dmab-OH
图2 -Glu(ODmab)-的脱除Dmab反应Fig.2 Deprotection of -Glu(ODmab)-buchi
Dmab作为羧基的临时保护基，具有脱保护便捷、温和、选择性高以及与常规Fmoc/tBu策略
的固相多肽合成技术相容性高等特点. 基于Fmoc/tBu/Dmab三维正交保护策略的固相合成内酰胺环肽的方法陆续有报道. CHAN等[5]使用该策略合成了一种类速激肽拮抗剂环肽，即将Fmoc-Glu-ODmab固定在树脂上，肽链构建完毕后直接在固相上进行环化反应，然后，从树脂上裂解下来得到目标环肽. 随后，其他带三功能基团氨基酸Asp[8]、Tyr[9]、Lys[10]也相继有用于该策略合成环肽的报道. 另外，该策略还可以用来合成某些复杂的多肽，如糖肽[2]或杂环肽[3].
但是一些研究在应用Fmoc/tBu/Dmab策略合成多肽时发现[5-6]，Dmab在作为Glu和Asp的羧基保护基时，脱除反应效率不稳定，有时会大大影响目标产物产率. 我们在研究中也发现了该现象. 因此，设计了含有Glu和Asp的两个肽链，采用Fmoc/tBu/Dmab策略构建线性肽树脂，研究了固相树脂上Dmab作为羧基保护基时α-ODmab、β-ODmab和γ-ODmab的保护基脱除反应的差异，探索Dmab使用的条件及规律.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
主要仪器：Agilent 1100分析型HPLC，Agilent 6410 Triple Quad LC/MS(Agilent公司，美国)；R-200旋转蒸发仪(Buchi公司，瑞士).
主要试剂：2-氯代三苯甲基氯树脂(2-CTC Resin)、Fmoc保护氨基酸(Fmoc-Glu(ODmab)-OH，Fmoc-Glu-ODmab，Fmoc-Asp(ODmab)-OH，Fmoc-Asp-ODmab，Fmoc-Glu-OtBu，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-D-Phe-OH)、苯并三唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)，GL Biochem公司；二异丙基乙胺 (DIEA)，J&K Chemical公司；2,2,2-三氟乙醇(TFE)，Alfa Aesar公司；谱纯乙腈(ACN)，谱纯甲醇(MeOH)，Sigma公司；水合肼(N2H4·H2O)，TCI试剂公司；其他试剂均为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 肽树脂的制备
以肽树脂1(H2N-(-GluOtBu-)4-GluODmab-Resin)的合成为例.
将Fmoc-Glu-ODmab 1.36 g(2.0 mmol)溶于DCM 20 mL中，加入DIEA 350.0 μL(2.0 mmol)，
配成氨基酸溶液. 称取的2-CTC Resin 2.05 g(0.933 mmol·g-1)置于固相反应器中，立即加入氨基酸溶液，振荡5 min；再次添加DIEA 525.0 μL(3.0 mmol)，室温振荡反应1.5 h. 加入MeOH 1 640.0 μL，振荡15 min，封闭剩余树脂位点. 用DCM(20 mL×3)、DMF(20 mL×2)、DCM(20 mL×2)、MeOH(20 mL×3)依次洗涤树脂，抽干并转移树脂至培养皿中干燥12 h. 称重树脂，得3.06 g，增重1.01 g；经计算，被固定在树脂上的保护氨基酸的量约为1.5 mmol.
将氨基酸树脂转至固相反应器中，DCM溶胀15 min，DMF(20 mL×3)洗涤，20% /DMF溶液(20 mL×2)脱除Fmoc保护基2次(2 min，8 min)，DMF(20 mL×5)洗涤. 称取Fmoc-Glu-OtBu 1.92 g(4.5 mmol)、HBTU 1.62 g(4.3 mmol)、HOBt 0.61 g(4.5 mmol)，溶于25 mL DMF中，加入DIEA 1.58 mL(9.0 mmol)，活化5 min. 将活化好的氨基酸溶液加入固相反应器内，反应1.5 h，DMF(20 mL×5)洗涤. 取少量树脂用Kaiser Test检测为阴性后，进行下一个氨基酸的连接. 上述方法依次连接氨基酸Fmoc-Glu-OtBu×3，偶合反应后均进行Kaiser Test定性检测树脂上的偶合效率，显反应为阴性即可进入下一个偶联循环；若结果为阳性，则重新投入活化好的氨基酸溶液，再次进行该循环反应. 最后，使用20% /DMF溶液(20 mL×2)脱除Fmoc保护基，即可得到载有Dmab保护基的肽树脂1.
用相同的方法合成肽树脂2(H2N-(-GluOtBu-)4-Glu(ODmab)-Resin)、肽树脂3(H2N-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-AspODmab-Resin)、肽树脂4(H2N-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(ODmab)-Resin).
1.2.2 Dmab的脱除
称取0.10 g肽树脂1,2,3,4分别置于固相反应器内，用2% N2H4·H2O/DMF(2 mL×2)溶液脱除Dmab保护基2次(10 min×2)；DMF(2 mL×3)、DCM(2 mL×2)、MeOH(2 mL)、DCM(2 mL×3)依次洗涤树脂，抽干.
1.2.3 肽树脂的裂解
将上述肽树脂转移至圆底烧瓶内，置于冰水浴中，加入裂解液(按体积比配置：DCM+TFE+HOAc(8+1+1))1 mL，电磁搅拌，反应30 min；过滤，滤液在旋蒸仪上减压除去溶剂，残留的醋酸通过反复加入正己烷后减压除去，得到粗肽样品.
1.2.4 产物的分析
使用0.1% TFA/ACN溶解样品，进行RP-HPLC分析(使用Agilent 1100 HPLC，谱条件为：Vydac 218TP54 C18(4.6×150 mm)分析柱；流动相A为0.1% TFA/H2O溶液，流动相B为0.1% TFA/ACN溶液；洗脱梯度为0～30 min，10%～70% B；进样体积为3 μL，流速为1 mL/min，检测波长为214 nm)；收集主要馏分，进行ESI-QQQ-MS分析(使用Agilent 6410 Triple Quad MS，质谱条件为：毛细管电喷雾电压为4 kV，采用正离子检测模式，质量扫描范围m/z 125～1 100).
2 结果与讨论
2.1 Glu残基的α-ODmab、γ-ODmab保护基脱除
为了比较Glu的α-ODmab和γ-ODmab的脱保护，以线性肽LγE5(图3)为目标产物，采用Fmoc/tBu/Dmab三维保护策略，设计合成了肽树脂1和2：
肽树脂1：H2N-(-GluOtBu-)4-GluODmab-Resin
肽树脂2：H2N-(-GluOtBu-)4-Glu(ODmab)-Resin
图3 线性肽LγE5的结构Fig.3 Structure of LγE5
肽树脂1和2分别以Glu的γ-COOH和α-COOH与树脂连接，相应的另一个羧基由Dmab保护，则肽树脂1和2上Dmab的脱除反应分别对应α-ODmab和γ-ODmab的脱保护反应.
肽树脂1和2分别经2% N2H4·H2O脱除Dmab保护基后，裂解肽树脂，得到产物粗肽1和2. 粗肽1经HPLC和ESI-MS分析显示(图4)，主要馏分(tR=14.2 min)的[M+H]+为888.1 Da，与LγE5的理论值888.5 Da相符，即该馏分为LγE5. 粗肽2经HPLC(图5)和ESI-MS分析(图6)结果显示，谱峰a馏分(tR=13.6 min)的[M+H]+为993.5 Da，谱峰b馏分(tR=14.0 min)的[M+H]+为888.4 Da(目标肽LγE5的理论值为888.5 Da)，即馏分b为LγE5，而馏分a中含有比目标肽大105 Da的组分.
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