汞胁迫对桐花树幼苗根和叶蛋白质功能的影响
设计方案目录：
1. 研究现状
2. 研究目标
3. 研究方案
  3.1 基本生理指标的测定
    3.1.1丙二醛（MDA）的测定
    3.1.2 还原糖的测定
    3.1.3 叶绿素的测定
    3.1.4 谷胱甘肽（GSH）的测定
    3.1.5 过氧化物酶（POD）的测定
    3.1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的测定
    3.1.7 过氧化氢酶（CAT）的测定
    3.1.8 总汞的测定
  3.2 蛋白质指标的测定
    3.2.1 自我总结500字超薄切片制作及电镜观察
    3.2.2可溶性蛋白含量测定
    3.2.3 蛋白的层析分析
    3.2.4 非蛋白巯基（non-protein thiol，NPT）含量的测定
    3.2.5 细胞可溶部分Hg的分子分布
4. 经费预算
参考文献
1. 研究现状
    红树林是指自然分布于热带亚热带海陆交汇的潮间带木本植物落，是海滩上特有的森林类型, 21岁当总裁红树植物是该生态系统各级消费者物质和能量的主要来源，对维护生态平衡，保护海岸生态系统起着重要的作用(林鹏等，1995；林鹏，1997)。红树植物是热带、亚热带海湾河口优势植物种, 是该生态系统的重要初级生产者, 对维护海湾河口地区的生态平衡起着十分重要的作用。近年来，随着江河流域工农业的发展，沿海城市人口与经济的增长，大量排放的污染物汇集于河口、海湾区，从而使重金属污染日趋严重。汞是一种极毒的重金属元素, 其毒性位于各金属之首。汞分为无机汞和有机汞两大类, 后者的毒性比前者更大。当植物体中汞的积累浓度达到一定范围后, 它就会破坏细胞的结构（解凯彬等，2000；李大辉等，1999；施国新等，2000；郝怀庆，2001），轻则使植物体内代谢过程发生紊乱, 生长发育受阻, 重则可造成植物枯萎, 甚至衰老死亡（张义贤，1997）。由于它极易经大气、水源和土壤进入植物体内, 然后再通过食物链进入动物和人体中, 对其造成极大的毒危害, 有的甚至能引起人的神经系统出现严重缺陷, 表现出强烈的致畸、致癌和致突变活性。桐花树（Aegiceras corniculatum）是具有一定的耐盐和泌盐性红树植物，也是我国分布最广的红树树种之一（高桂娟等，2009）。本文以红树植物桐花为材料，观察其在不同Hg浓
度胁迫下的生理生态变化，以及叶、根细胞中蛋白质的适应性变化，为揭示红树植物的耐Hg机制提供一些理论和实践依据。
2. 研究目标
    西南科技大学分数线红树林作为一种海岸潮间带森林生态系统, 对海湾河口区域的污染具有较高承载力和耐受性。目前，在红树植物对重金属污染响应方面的研究主要集中于红树植物对重金属的富集以及生长、形态和生理学方面, 对红树植物抗污染胁迫的分子机理方面的研究还极少有报道。分子生物学和生态学原理的结合, 为污染生态学的研究开辟了一个广阔的研究领域（李裕红，章幼玉，2007）。
    本实验以红树植物桐花为材料，观察其在不同Hg浓度胁迫下的生理生态变化，以及叶、根细胞中蛋白质的适应性变化，为解释红树植物的耐Hg机制提供一些理论和实践依据。在蛋白质水平探讨红树植物对重金属具较高耐受性的分子生态机理, 可能发现在红树植物中普遍存在的高效的重金属结合物质及其控制基因, 可为汞污染的植物生理学监测提供理论基础，也可为研究红树植物抗重金属污染机制及红树林生态环境的保护提供科学依据和实践依据。
3. 研究方案
挑选当年生株高约20~30 cm，4~5对叶片，且生活力强，无病虫害，大小相近的桐花树（Aegiceras corniculatum）幼苗进行试验。首先进行水培，加1/4 Hogland营养液于实验室外自然光下复壮一周（室温约25 ℃），准备实验。
复壮后，幼苗用自来水冲洗干净并用超纯水冲洗3遍后进行不同浓度的Hg（0、0.2、1、10、50 ppm）胁迫处理，胁迫液为HgCl2溶液和1/4 Hogland营养液的混合液。每处理3个重复，每重复5~6株幼苗。5天后分别取5种胁迫浓度的秋茄幼苗进行实验。
3.1 基本生理指标的测定
3.1.1丙二醛（MDA）的测定
采用硫代酸法测定秋茄叶片和根的MDA含量。参照赵世杰等方法，选取新鲜成熟叶，去除中脉剪碎混匀称取0.5 g样品，加入3 mL 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆移至王者周瑜15 mL离心管；再加入2 mL 10％TCA将研钵中的残渣洗入离心管。匀浆在4000 r/min离心10 min。
测定：取上清液2 mL（对照组2 mL H2O）于新的15 mL离心管中，加入2 mL 0.6%TBA（用10%三配制）混匀，离心管盖子拧紧。混合物于沸水浴中沸煮15 min，迅速冷却后在4000 rpm，4℃，离心20 min。取上清液测定OD532、OD450。
计算：提取液中MDA的含量
C(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450
然后计算每克样品中MDA含量
3.1.2 还原糖的测定
采用蒽酮比法（李合生，2000）测定秋茄叶片的可溶性糖含量。称取干样0.0500～0.1000 g(0.0500~0.0700 g），分别加入15 mL刻度离心管中；加蒸馏水10 mL，置沸水浴中提取30 min，冷却离心，上清液倒入50 mL PE瓶中，再往离心管中加10 mL蒸馏水，置沸水浴第二次浸提，上清液倒入PE瓶中，向瓶中加入蒸馏水至50 mL左右，称重。
吸取测定液0.5 mL于大试管中，加蒸馏水摇匀，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯，放入波长630 nm的分光光度计中比。
结果计算：可溶性糖％＝测定液糖含量(μg)×10-6/干样重(g)×分取倍数×100％
3.1.3 叶绿素的测定
    参照张宪政（张宪政，1986）的乙醇-丙酮混合液法略有改进。选取新鲜成熟叶片，去除中脉剪碎混匀称取0.1～0.2 g叶片。等体积乙醇、丙酮混合液10 mL浸泡（乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1），并用保鲜膜封口防止提取液挥发，置于阴暗处并定期震荡。浸泡至组织变白后，使用紫外分光光度计分别于波长663 nm、645 nm处测定其抽提液的OD值。根据以下公式计算叶绿素含量：
Ca=12.7×OD663－2.69×OD645 (2.1) 
Cb=22.9×OD645－4.86×OD663 (2.2)
Ca+b=8.02×OD663+20.20×OD645 (2.3)
叶绿体素的含量= （mg/g）
（C为叶绿素浓度，以μg/mL表示）
3.1.4 谷胱甘肽（GSH）的测定
（1）谷胱甘肽标准曲线的制作
取6支试管编号，按下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10 min。以0号管为参比调零，测定显液在波长412 nm 处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量为横坐标，绘制标准曲线。
表 1 谷胱甘肽标准曲线制作时各试剂加入量
针织衫搭配
试管号
100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml
蒸馏水/mL
0.1mol/L PH7.7磷酸缓冲液
0.1mol/L PH7.7磷酸缓冲液
相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol
0
0
1.0
1.0
0.5
0
1
0.2
0.8
1.0
0.5
20
2
0.4
0.6
1.0
0.5
40
3
0.6
0.4
1.0
0.5
60
4
0.8
0.2
1.0
0.5
80
5
1.0
0
1.0
0.5
100
（2）提取
    称取1 g 样品于研钵中，加入5 mL 经4℃预冷的50 g/L三溶液（含5 mmol/LNa2-EDTA），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、19000 g离心15 min（15 mL离心管）。收集上清液用来测定谷胱甘肽含量，测量提取液总体积（V？）
（3）谷胱甘肽的测定
    GSH留别王维唐孟浩然测定液的制备：将液氮固定的鲜样组织放于研钵中，加入一定量的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（含0.005 mol/L EDTA）（PH 8.0）和25%偏磷酸（HPO3），并加少量石英砂，冰浴上充分研磨，冷冻离心（4℃，18000 g 15 min），上清液冷藏用于GSH的测定。GSH测定采用荧光分光光度法，参照Gupta等和Hissin等的方法（？）。
    测定：取1支5 mL离心管，依次加入1 mL蒸馏水、1 mL0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）和0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412 nm处对分光光度计进行调零。
另取2支试管，分别加入1 mL（Vs）上清液、1 mlL0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）。向一
支试管中加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液，另一支试管加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH6.8）。将两支反应管置于25℃保温10 min。按照标准曲线的方法，迅速测定显液在波长412 nm处的吸光度，分别记做ODS和ODC。